鳖甲通过下调ENO3和PFKM调节糖酵解通路在斑马鱼模型中抑制血管生成的研究

【摘要】：研究背景和目的:恶性肿瘤的发病率及死亡率呈逐年上涨趋势,造成极大的医疗负担。肿瘤的生长和转移都依赖于血管的形成。由于分子医学的快速发展,靶向药物在抗肿瘤血管生成方面得到了极大进展。但由于肿瘤具有多种血管重塑的代偿机制,传统的靶向抗血管生成药物治疗效果有限,且容易造成耐药。血管内皮细胞代谢与肿瘤细胞类似,都以糖酵解为主要供能方式。因此基于肿瘤血管内皮代谢的靶向抗肿瘤血管生成药物,目前已成为一种新的抗肿瘤血管生成策略。中医认为恶性肿瘤的基本病机是由于正气亏虚,痰饮、瘀血、癌毒等病理产物堆积形成的有形肿块。由于肿瘤形成后,聚结成块,坚硬如石,故有的医家将之称为“岩”,并提出了软坚散结的治法。中医药在治疗恶性肿瘤方面发挥了重要作用,已有大量研究证实中药具有显著的抗肿瘤血管生成作用,但具体的分子机制有待进一步挖掘。高通量DNA基因测序技术具有高准确性、高灵敏度等特点,被广泛运用于分子生物医学领域。而斑马鱼作为一种新兴的生物研究模型,具有高通量和活体实验等特点,且在早期胚胎发育过程中,胚胎透明,可以直接观察到各组织器官,已被广泛用于抗血管药物的筛查。因此,本研究通过RNA-Seq测序技术对具有软坚散结功效的中药—鳖甲进行系统和深入的研究,为中药鳖甲抑制肿瘤血管生成的机制提供一定的研究基础。研究方法:1、采用高效液相色谱法(HPLC)对中药鳖甲所含各种化学成分进行分析,测定其指纹图谱信息。2、采用煎煮、浓缩、过筛、干燥等方法提取鳖甲水提物。选用TG品系fli1a-EGFP转基因斑马鱼,在鱼水中加入鳖甲水提物(工作浓度200mg/ml),对照组中加入PTK787(工作浓度5mg/ml),分别干预受精后22hpf的斑马鱼胚胎直至48hpf,干预结束后,将各组胚胎在体式荧光显微镜下进行血管表型观察和拍照,分析各组对斑马鱼体节间血管(ISVs)生成的影响,评价鳖甲水提物对斑马鱼胚胎新生血管表型的影响。3、提取鳖甲水提物干预后具有新生血管抑制表型斑马鱼胚胎组织中的RNA,构建全转录组文库,进行二代高通量测序,分析确定所有RNA水平调控及表达基因。全面检测鳖甲干预斑马鱼基因的动态变化信息,并对基因组学的研究结果进行生物信息学分析。4、提取鳖甲水提物干预后的斑马鱼胚胎组织中的RNA,通过实时荧光定量PCR检测ENO3和PFKM及糖酵解通路相关差异表达基因的变化情况。研究结果:1、鳖甲指纹图谱与相应的参照物具有保留时间相同的共有色谱峰,且相似度均大于0.9。2、与空白对照组相比,鳖甲水提物干预的实验组斑马鱼胚胎的ISVs的荧光表达部分消失,且仅能观察到少量DLAV,提示中药鳖甲水提物具有抑制斑马鱼胚胎新生血管生成的作用。3、高通量RNA-seq测序分析共获得鳖甲水提物干预后的具有新生血管抑制表型的斑马鱼胚胎组织的差异表达基因3821个,其中有1781个差异表达基因显著下调,2040个差异表达基因显著上调,差异表达显著基因中GO分析以生物学过程为主,主要与代谢有关。KEGG通路分析显示,上调的mRNA涉及10个通路,下调的mRNA涉及32个通路,而涉及显著富集的糖酵解/糖异生信号通路中有7个基因显著下调。4、RT-qPCR结果表明鳖甲干预后具有新生血管抑制表型斑马鱼胚胎组织中ENO3和PFKM及糖酵解相关通路中其他差异表达基因显著下调,与RNA-seq测序结果一致。结论:鳖甲水提物能抑制TG品系fli1a-EGFP转基因斑马鱼胚胎血管的形成,其可能的机制与通过下调ENO3和PFKM调节糖酵解通路有关。