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硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究

孔競谊  
【摘要】:目的:观察硝菔通结方对慢传输型便秘(STC)模型大鼠结肠动力、肠神经系统网络结构(ENS-ICC-SMC)及结肠细胞自噬与凋亡的影响,从细胞自噬与凋亡调控组织结构功能稳态的角度探讨硝菔通结方治疗STC的作用机制,为补肾益精法治疗便秘提供新的研究思路。方法:1.随机将SD大鼠110只分为空白组40只,造模组70只。运用大黄粉混悬液递增剂量三轮循环法对造模组大鼠进行慢传输型便秘模型复制,并在造模过程中粪便形质改变的3个时间节点每组各取10只大鼠处死,HE染色观察结肠病理,免疫荧光铺片观察肌间神经丛,透射电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构及自噬体,Western-Blot检测结肠肌层ENS-ICC相关蛋白PGP9.5、c-kit、Cx43、Sy,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、caspase-3表达水平,TUNEL法检测结肠肌层细胞凋亡情况。造模结束后根据大鼠首粒黑便排出时间,判断造模是否成功。2.造模成功后将剩余大鼠分为空白组(K组),模型组(M组)、莫沙必利组(S组)、张锡纯硝菔通结汤原方组(Z组)及硝菔通结方组(X组),予以对应药物灌胃4周。观察各组大鼠的体质量、首粒黑便排出时间、便量,检测在体结肠肌电。取结肠组织,HE染色观察病理学,免疫荧光铺片观察肌间神经丛,透射电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构;免疫荧光及Western-Blot检测肌层PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43、Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、mTOR的表达水平;RT-PCR检测肌层Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3mRNA的表达水平。结果:1.STC模型大鼠ENS-ICC-SMC与结肠细胞自噬、凋亡的变化(1)ENS-ICC-SMC形态学变化:随着造模程度的发展,HE染色出现炎性细胞浸润,固有膜肿胀,肌层纤维坏死,肌细胞核固缩、深染或溶解消失,肌间神经丛神经细胞空泡变性、数量减少;肌间神经铺片显示结肠肌间神经丛神经分布逐渐稀疏,神经元变少,纤维及胞体细小;透射电镜显示肠神经细胞线粒体肿胀,甚则形成空泡样结构,偶见自噬小体及凋亡现象;ICC少见,偶有可见其细胞核较大,核内染色质边集,细胞质内少量线粒体,线粒体肿胀,胞质内空泡形成;平滑肌细胞细胞核染色质边集,胞质内可见大量空泡等病理性改变;细胞间隙变宽。(2)ENS-ICC相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠PGP9.5、Cx43有减少趋势(P0.05),c-kit、Sy表达减少(P0.05),造模2、3阶段大鼠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43表达均减少(P0.05/P0.01)。(3)自噬相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠Beclin-1表达增多,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值减小(P0.05),p62表达有减少趋势(P0.05);造模2阶段大鼠Beclin-1表达减少(P0.05),LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值有增大趋势,p62表达有增多趋势(P0.05);造模3阶段大鼠Beclin-1表达减少,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值增大,p62表达增多(P0.01)。(4)凋亡相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠bcl-2/bax的比值及caspase-3表达无明显变化(P0.05);造模2、3阶段大鼠bcl-2/bax的比值减小,caspase-3表达增多(P0.05/P0.01);TUNEL法显示造模2、3阶段大鼠结肠肌层中细胞凋亡增多(P0.01)。2.硝菔通结方对大鼠体质量、首粒黑便排出时间、便量及结肠肌电的影响(1)对体质量的影响:相较于K组,M组体重增长缓慢(P0.01);相较于M组,各给药组大鼠体重增长加快(P0.01)。相较S组及Z组,X组大鼠体重增长较快(P0.05)。(2)对首粒黑便及便量的影响:相较于M组,各组大鼠首粒黑便排出时间变短,便量增多(P0.01);相较于Z组,X组大鼠便量增加(P0.05)。(3)对结肠肌电的影响:相较于K组,M组频率减慢、振幅减小(P0.01);相较于M组,S组及X组频率增加,振幅加大(P0.05/P0.01),Z组频率增加(P0.05),振幅有加大趋势(P0.05)。3.硝菔通结方对STC模型大鼠结肠ENS-ICC-SMC的影响(1)对ENS-ICC-SMC形态学的影响:各给药组HE染色显示炎性浸润减轻,肌层纤维坏死减少,肌细胞及肌间神经丛神经细胞变性减轻;肌间神经丛铺片显示神经丛神经分布增多,神经元数量及形态恢复;透射电镜显示神经细胞、ICC、SMC内线粒体肿胀等病变减轻,ICC增多,细胞连接增强,以X组最明显。(2)对ENS-ICC相关蛋白的影响:M组PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43荧光强度弱于K组,各给药组荧光强度强于M组;蛋白印迹法显示S组及X组PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43的表达增多(P0.05/P0.01),Z组PGP9.5表达有增多趋势(P0.05),c-kit、Sy、Cx43的表达增多(P0.05);相较于Z组,X组PGP9.5、Sy、c-kit的表达增多(P0.05)。4.硝菔通结方对STC模型大鼠结肠自噬与凋亡的影响(1)对自噬相关蛋白的影响:M组Beclin-1、LC3荧光强度弱于K组,p62荧光强度强于K组,各给药组Beclin-1、LC3荧光强度强于M组,p62荧光强度弱于M组;蛋白印迹法显示S组及X组Beclin-1表达增多(P0.05/P0.01),Z组及X组p62表达减少(P0.05/P0.01),LC3Ⅰ/Ⅱ的比值减小(P0.05);相较于Z组,X组Beclin-1表达增多,p62表达减少(P0.05),相较于S组,X组p62表达减少(P0.05)。(2)对自噬相关mRNA的影响:相较于K组,M组大鼠Beclin-1、LC3、p62 mRNA的表达量降低(P0.01);相较于M组,S组及X组大鼠Beclin-1mRNA的表达量增多(P0.05/P0.01),相较于Z组,X组大鼠Beclin-1 mRNA的表达量增多(P0.05),各组LC3、p62 mRNA无明显变化(P0.05)。(3)对凋亡相关蛋白的影响:M组bcl-2、bax、caspase-3荧光强度强于K组,各给药组荧光强度弱于M组;蛋白印迹法显示S组及X组bcl-2/bax的比值增大(P0.01),caspase-3表达减少(P0.05/P0.01),Z组bcl-2/bax的比值有增大趋势,caspase-3表达有减少趋势(P0.05),相较于Z组,X组bcl-2/bax的比值增大(P0.05)。(4)对凋亡相关mRNA的影响:相较于K组,M组bcl-2、bax、caspase-3 mRNA表达升高(P0.01);相较于M组,各组bcl-2 mRNA表达有减少趋势(P0.05),bax mRNA减少(P0.05),Z组caspase-3 mRNA表达有减少趋势(P0.05),S组及X组caspase-3 mRNA表达减少(P0.05)。(5)对mTOR的影响:M组荧光强于K组,各给药组荧光弱于M组;蛋白印迹法显示相较于K组,M组p-mTOR表达增多,p-mTOR/mTOR的比值增大(P0.01);相较于M组,S组及Z组p-mTOR/mTOR的比值有减小趋势(P0.05),X组p-mTOR蛋白表达减少,p-mTOR/mTOR的比值减小(P0.05)。结论:1.慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍与肠神经系统网络结构损伤程度有关,自噬与凋亡异常可能参与其肠神经系统网络结构损伤过程。2.硝菔通结方能改善慢传输型便秘模型大鼠的便秘症状,缩短首粒黑便排出时间,增加粪便量,增强结肠肌电频率和振幅,促进肠神经系统网络结构修复,提高PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43表达。3.硝菔通结方可能通过抑制结肠肌层mTOR磷酸化,增多Beclin-1的表达,减小LC3Ⅰ/Ⅱ比值,减少p62的表达,增强细胞自噬活性,减少bax表达,增大bcl-2/bax比值,减少caspase-3表达,减少细胞凋亡。4.硝菔通结方可能通过调控结肠细胞自噬及凋亡,促进肠神经系统网络结构修复,进而纠正慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍,改善便秘症状,补肾益精法在其中发挥重要作用。


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