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补骨脂素联合TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

高子茏  
【摘要】:目的:建立有效的骨髓干细胞培养及鉴定体系;探索补骨脂素对于骨髓间充质干细胞的最佳生长浓度;观察补骨脂素联合转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的作用。为细胞组织工程技术治疗大鼠膝关节软骨损伤的动物实验提供实验基础,进而探索中药在组织工程修复技术中的潜力和实用价值;同时为补骨脂“益肾气、强筋骨”的中医功效提供可靠基础实验依据。方法:实验一:对SD大鼠骨髓间充质干细胞进行提取、纯化及鉴定:采用大鼠股骨全骨髓提取+细胞贴壁法分离、提取大鼠骨髓间充质干细胞,对大鼠BMCS进行体外培养及扩增;通过研究其形态结构、流式细胞术共同鉴定。实验二:配置不同浓度梯度的补骨脂素培养液培养骨髓间充质干细胞,用CCK-8法检测含不同浓度补骨脂素培养液对细胞生长的作用。实验三:补骨脂素体外联合转移生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。1.体外诱导及分组,设置正常对照组(LG-DEME、10%FBS、双抗),补骨脂素组(10umol/L补骨脂素、LG-DEME、10%FBS、双抗),补骨脂素联合TGF-β1组(10umol/L补骨脂素、10ng/m LTGF-β1、LG-DEME、10%FBS、双抗),阳性诱导组(10ng/m LTGF-β1、LG-DEME、10%FBS、双抗)。14d后,光学显微镜观察诱导后的细胞形态,进行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色;运用RT-PCR技术检测软骨分化标记基因Ⅱ型胶原和Sox9的m RNA表达情况;采用Western-blot检测Ⅱ型胶原蛋白和Sox9的表达量。结果:1.光镜观察原代培养后首次换液,去除未贴壁细胞,大部分细胞呈梭型、三角形,小部分呈圆形。代后细胞纯化,形态均一,杂质细胞极少见。2.骨髓间充质干细胞流式细胞学鉴定显示实验所培养的细胞广泛高度表达CD90、CD44,而极少表达CD43、CD45。3.CCK-8法检测不同浓度的含补骨脂素完全培养基均可促进骨髓间充质干细胞生长增殖,尤以浓度为10umol/L的补骨脂素完全培养基效果最佳。4.骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向诱导后鉴定:4.1倒置显微镜观察:诱导两周骨髓间充质干细胞后体积增大,表现为多边形、三角形、星形,有多个突起。4.2 II型胶原免疫细胞化学染色:正常对照组未见阳性细胞,其余3组均可见阳性细胞,胞浆呈棕红色。4.3 Western-blot结果:与正常对照组相比,其余3组Ⅱ型胶原和Sox9的表达增高(P0.05),其中联合组效果最佳(P0.01);与补骨脂素组和阳性诱导组比较,联合组的Ⅱ型胶原的表达均增高(P0.05)。4.4 RT-PCR结果:与正常对照组相比,其余3组Ⅱ型胶原基因和Sox9基因表达增高(P0.05),其中联合组效果最佳(P0.01);与补骨脂素组和阳性诱导组比较,联合组的Ⅱ型胶原基因的表达均增高(P0.05)。结论1.全骨髓贴壁法贴壁效率高、首次传代时间短、持续增殖能力及细胞活力强;1.CD44、CD90是两种MSCs重要的表面标志物,BMSCs的CD44、CD90表达阳性。因此可作为鉴定BMSCs的一种实用方法。3.不同浓度和时间段的补骨脂素的刺激,BMSCs的增殖得到了增强,以10μmol/L情况下效果最好。4.补骨脂素联合TGF-β1能促进大鼠骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达,诱导其向软骨细胞分化。且效果要优于单独使用补骨脂素效果。为进一步将中药用于组织工程技术治疗大鼠骨关节炎的在体实验提供了实验基础。


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