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余甘子叶有效化学成分及其抗肿瘤作用的研究

钟益宁  
【摘要】: 1目的:余甘子(Phyllanthus Emblica L)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)落叶灌木或小乔木。广泛分布于我国广西、广东、云南、福建、贵州等地。余甘子的果实,根,茎和叶均可入药,文献报道余甘子与35种治疗功效有关,为17个国家和民族广泛使用,是多版中国药典收载的中药品种。余甘子叶是中药余甘子的重要药用部位,其味甘、微苦、性凉:归脾、小肠经。具有清热解毒,利湿消肿,祛湿利尿之功效;临床用于口腔溃疡、绣球风、疔疮、皮炎、水湿肿满、痔漏、高血压、毒蛇咬伤、跌打损伤的治疗。目前,有关余甘子叶的有效化学成分、药理作用、质量评价以及开发利用等方面的系统研究鲜有报道。本论文是广西科技厅项目《余甘子叶抗菌、抗肿瘤有效物质基础的研究和抗菌、抗肿瘤药效筛选研究的技术平台建设》(桂科基0639051)的重要组成部分,是以余甘子叶为研究对象,系统地研究其有效化学成分、药理作用和质量控制,为开发利用余甘子叶部位药材提供基础化学、药理和质量评价依据。 2方法:全文共分四个部分:一、结合文献调研,综述余甘子的最新研究进展。二、系统地研究余甘子叶的化学成分:1、对余甘子叶进行系统成分预试验。2、用10倍量95%乙醇,50%乙醇依次浸泡余甘子叶粗粉,渗漉、回收溶剂得浸膏后,依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇回流提取,得到3个不同极性的提取部位。3、对这些部位进行分离纯化和结构鉴定。采用大孔树脂、聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、制备液相、Sephadex-LH-20、制备薄层等方法重点对药理活性较强的乙酸乙酯、正丁醇部位进行分离纯化,并根据理化性质和UV、IR, EI-MS、1H-NMR、13C-NMR等鉴定技术鉴定化合物的结构。三、采用TLC和HPLC法,以没食子酸为指标性成分,对余甘子叶进行了定性定量分析研究,并对广西境内不同产地余甘子叶的没食子酸含量进行了测定和分析比较。四、研究余甘子叶的化学成分没食子酸对人肝癌BEL-7404细胞株凋亡的影响。采用MTT法测定没食子酸在体外对BEL-7404细胞的增殖影响;利用普通光学显微镜,倒置相差显微镜和荧光显微镜观察没食子酸作用于BEL-7404细胞后的形态学变化;AnnexinV/PI双标记法流式细胞术检测没食子酸诱导BEL-7404细胞早期凋亡的情况;TUNEL法检测BEL-7404细胞凋亡情况及其凋亡率。 3结果:调研文献,对余甘子的化学成分、药理以及临床应用等方面作了系统的综述。预实验表明余甘子叶中含有酚类、有机酸、还原糖、多糖、黄酮类、三萜等成分。从石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三个部位分离纯化得到11个化合物。经鉴定分别为:β-谷甾醇(β-Sitosterol,Ⅰ),β-胡萝卜苷(β-Carotene,Ⅱ),篇蓄苷(Avicularin,Ⅲ),山奈酚(Kaemferol,Ⅳ),槲皮素(Quercetin,Ⅴ),山奈酚-7-甲醚(kaempferol-7-methylether,Ⅵ);鞣花酸(ellagic acid,Ⅶ);没食子酸(gallic acid,Ⅷ);没食子酸乙酯(ethyl gallate,Ⅸ);正三十四烷酸(tetratriacontanoic acid,Ⅹ)和正三十烷醇(1-Triacontanol,Ⅺ)。其中Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ是首次从余甘子叶中分离得到的化合物。研究了没食子酸的定性定量测定方法,该方法简便、准确,重现性、回收率好,可作为余甘子叶药材的质量控制方法。测定结果表明不同产地余甘子叶的没食子酸含量有较大差异,.相差近10倍,以钦州灵山县的没食子酸含量最高,达到0.498 mg.g-1。研究表明余甘子叶化学成分没食子酸能抑制BEL-7404细胞的增殖并诱导其产生凋亡,对BEL-7404细胞的凋亡呈时间依赖性。 4结论:本课题立足中医中药理论,依据余甘子叶的性味和归经、功能和主治以及临床应用进行药理筛选,并结合化学成分特点,首次从余甘子叶分离得到Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ等化合物。首次采用没食子酸为余甘子叶的指标成分,对其进行了定性定量分析研究,并对不同产地的余甘子叶没食子酸含量作分析比较,为检测、控制余甘子叶药材及其制剂的质量提供理论依据。首次对余甘子叶化学成分没食子酸进行抗人肝癌BEL-7404药理作用研究,结果表明没食子酸能抑制人肝癌BEL-7404细胞的增殖,而且抗肿瘤作用是通过诱导癌细胞凋亡的方式进行的,该研究为评价余甘子叶的抗肿瘤药理作用以及阐明其作用机理奠定了理论基础,为开发余甘子叶的保健品和创新药提供了一定的科学依据。


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