家蚕黑色素合成途径基因的分子进化

【摘要】：家蚕在大约5000年前由中国野桑蚕驯化而来,长期的人工选择使家蚕的体色发生了不同于野桑蚕的显著变化。迄今为止,家蚕和野桑蚕之间体色差异的分子机制尚不清楚。随着家蚕基因组框架图、精细图和重要遗传资源重测序的相继完成,数以十万计的EST以及基因全长cDNA序列的陆续公布,为从分子水平上解析驯化选择对家蚕特定生物学性状形成的作用,阐释家蚕和野桑蚕之间生物学差异的遗传基础提供了可能。本研究首先通过对家蚕和野桑蚕体色差异进行比较,并使用透射电镜分析体壁超微结构的差异；其次,由于昆虫的黑色素主要通过黑色素合成途径产生,本研究利用生物信息学分析方法对家蚕基因组中的黑色素合成途径基因进行鉴定,并分析了各基因的时空表达模式；然后,以家蚕黑色素合成途径基因为标记,通过克隆测序分析,比较了家蚕和野桑蚕种内核苷酸多态性和种间分歧度,探索了基因核苷酸多态性与基因在代谢途径位置之间的关系；最后,通过中性检验、溯祖模拟分析、连锁不平衡分析、系统发生分析、单倍型网络结构分析以及实时定量PCR等,探测家蚕黑色素合成途径基因是否有人工选择的印记,并对人工选择的靶基因进行了鉴定,进而对人工选择的分子机制进行了推测。主要研究结果如下： 1.家蚕和野桑蚕的体色比较及体壁超微结构分析 无论是幼虫期、蛹期还是成虫期,家蚕体色与野桑蚕体色都存在显著的差异。家蚕幼虫除了眼状纹、半月纹及星状纹区域为黑色外,表皮的其他区域呈现出比较均一的白色。而相对于家蚕,野桑蚕五龄幼虫眼状纹、半月纹、星状纹以及尾角区域为赤褐色,表皮的大部分区域呈现出黑体色,也有小部分区域呈浅褐色。家蚕蛹体表为浅黄色,而野桑蚕的表皮呈现颜色较深的棕褐色。家蚕成虫为白体色,而野桑蚕全身呈现黑褐色,翅有黑色翅斑。 透射电镜观察发现,家蚕和野桑蚕体壁超微结构主要存在两个方面的差异：一是真皮层白色尿酸颗粒的数量不同,野桑蚕真皮层只有少量的白色尿酸颗粒,而家蚕真皮层含有大量白色尿酸颗粒；二是表皮外层不规则黑色素颗粒的有无,野桑蚕表皮外层含有大量黑色素颗粒,而家蚕的表皮外层没有黑色素颗粒的存在。 综合分析以上结果,可以得出,野桑蚕的体色为较深的黑色或褐色,而家蚕的体色呈现出白色或浅黄色；体壁超微结构分析结果能很好地阐释了家蚕和野桑蚕体色差异的物质基础,家蚕之所以呈现白体色,是因为真皮层含有大量白色尿酸颗粒；而野桑蚕的黑体色主要是由表皮外层沉积的大量黑色素导致。由此可见,驯化过程中家蚕体色的改变很可能与黑色素的合成差异相关,而昆虫中黑色素的合成主要通过黑色素合成途径来完成。 2.家蚕黑色素合成途径基因的鉴定和表达模式分析 参照黑腹果蝇黑色素合成途径9个基因的氨基酸序列,通过同源性比对,我们发现,家蚕基因组中都能搜寻到各自的同源基因,分别位于第1、第4、第8、第11、第13以及第26号染色体,但其中的yellow-f和yellow-f2两个基因对应了家蚕的同一个预测基因BGIBMGA014224。进一步分析基因结构发现,所有的基因都由多个外显子构成。 黑色素合成途径基因在家蚕五龄三天各组织中的表达模式分析发现,酪氨酸羟化酶基因TH主要在家蚕的头、表皮、脂肪体和气管中表达；多巴脱羧酶基因Ddc主要在家蚕的头、表皮、脂肪体、气管和生殖腺中表达；yellow和yellow-f基因主要在家蚕的头、表皮、丝腺和气管中表达；black和ebony基因主要集中在家蚕的头部表达；Datl基因集中在家蚕的头、表皮、丝腺和脂肪体中表达,其次在中肠和气管中也有微量表达；tan基因在所分析的8个组织中都有表达,其中在脂肪体中表达较低。 利用RT-PCR试验分析了黑色素合成途径基因在家蚕不同发育时期的表达特征,结果表明,TH基因在家蚕幼虫、蛹及成虫各个发育阶段都有表达,其中蜕皮期表达量最高；Ddc基因的表达整体水平较低,但表达高峰仍然在蜕皮期；yellow基因表达量最高的时期也分布于一龄眠、二龄眠、三龄眠及四龄眠等蜕皮期；yellow-f基因与TH基因的表达模式相似,蜕皮期表达量最高,蜕皮后的初期表达量开始下降,而盛食期到蜕皮前这段时间基因表达量较低；black基因与yellow基因相似,在一龄眠、二龄眠、三龄眠及四龄眠等蜕皮期表达量最高,其他时期表达量较低；Datl基因在幼虫一龄到四龄的盛食期表达量很低,而从五龄四天到化蛹以及蛾期表达量都较高,同时,蜕皮期表达量也较高；ebony基因的表达主要集中在蜕皮期及蜕皮后的初期,还有就是蛹期和蛾期也有较高的表达水平,其余时期表达很微弱；tan基因在家蚕幼虫、蛹及成虫各个发育阶段都有表达,而且时期表达差异不明显。 综合分析以上结果,本研究成功鉴定了家蚕黑色素合成途径基因,并对其时空表达模式进行了分析。组织表达谱分析的结果表明,黑色素合成途径基因主要在家蚕头和表皮中高量表达,与家蚕黑色素主要分布于头和表皮相一致。时期表达谱分析的结果表明,黑色素合成途径基因表达高峰主要分布在蜕皮期,反映了家蚕黑色素的合成主要发生在蜕皮期间,同时也说明了黑色素合成途径基因可能与家蚕表皮的鞣化也紧密相关。这暗示了黑色素合成途径基因在家蚕驯化过程中并没有丧失功能。 3.家蚕和野桑蚕黑色素合成途径基因核苷酸多态性分析 本研究共测序了8个家蚕黑色素合成途径基因,每个基因包括30个样本(15个家蚕样本和15个野桑蚕样本)。基于全序列的家蚕核苷酸多态性(πtotal)分析发现,black基因的多态性最低,πtotal值为0.00031,而tan基因的多态性最高,πtotal值等于0.02891,家蚕黑色素合成途径8个基因的核苷酸多态性平均值为0.01340。相对于家蚕,基于全序列的野桑蚕黑色素合成途径基因的核苷酸多态性如下,TH基因的多态性最低,πtotal值为0.00977,而tan基因的多态性最高,πtotal值为0.03496,8个基因的核苷酸多态性平均值为0.02261。利用威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed rank test)进行统计分析结果表明,野桑蚕黑色素合成途径基因的核苷酸多态性显著高于家蚕黑色素合成途径基因的核苷酸多态性(P=0.01,df=7),40.7%的野桑蚕核苷酸多态性在家蚕中发生了丢失。如果基于群体多态性参数θw来进行分析,也可以得到相似的结果：家蚕中black基因的θw,值最低(0.00069),tan基因的θw值最高(0.02885),8个黑色素合成途径基因的平均值为0.01337；而野桑蚕中TH基因的θw值最低(0.01245),tan基因的θw值最高(0.04157),8个黑色素合成途径基因的平均值为0.02633。利用威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed rank test)进行统计分析结果表明,野桑蚕黑色素合成途径基因的核苷酸多态性显著高于家蚕黑色素合成途径基因的核苷酸多态性(P=0.01,df=-7),49.2%的野桑蚕核苷酸多态性在家蚕中发生了丢失。 黑色素合成途径8个基因可以分为两组：TH和black基因编码黑色素代谢途径最初的两个酶,分别将酪氨酸和尿嘧啶加工成黑色素前体,而Ddc、yellow、yellow-f、Dat1、ebony以及tan基因为代谢途径的下游基因。为了研究基因核苷酸多态性与基因在代谢途径位置的关系,我们对核苷酸多态性的高低是否受基因在代谢途径位置影响进行了评估。家蚕黑色素合成途径上游基因TH和black的核苷酸多态性的平均值为0.00064,而下游基因的核苷酸多态性的平均值为0.01765。利用t检验进行统计分析发现,家蚕黑色素合成途径上游基因的核苷酸显著低于下游基因(Student's t-test, P=0.0310, df=6).野桑蚕群体也有相似的结果：野桑蚕黑色素合成途径上游基因TH和black的核苷酸多态性的平均值为0.01273,而下游基因核苷酸多态性的平均值为0.02590,利用t检验进行统计分析发现,野桑蚕黑色素合成途径上游基因的核苷酸也显著低于下游基因(Student's t-test, P=0.0207, df=6)。这表明黑色素合成途径的位置的确影响了选择压力的分布,即上游基因比下游基因受到了更高水平的选择压力。 中性检验的结果表明,4个家蚕黑色素合成途径基因(TH, black、ebony以及yellow)和7个野桑蚕黑色素合成途径基因(TH, black, Ddc、Dat1、tan、yellow以及yellow-f)的Tajima's D值小于0,另外,3个家蚕黑色素合成途径基因(TH、black以及yellow)和7个野桑蚕黑色素合成途径基因(TH、black、Ddc、Dat1、tan、yellow以及yellow-f)的Fu and Li's D值小于0,这表明,家蚕和野桑蚕都可能经历了定向选择的作用。我们还可以发现,4个家蚕黑色素合成途径基因(Ddc、Datl、tan以及yellow-f)和1个野桑蚕黑色素合成途径基因(ebony)的Tajima's D值大于0,另外,5个家蚕黑色素合成途径基因(Ddc、Datl、tan、ebony以及yellow-f)和1个野桑蚕黑色素合成途径基因(ebony)的Fu and Li's D值大于0,这表明中等频率的等位基因过量,可能是由于群体的瓶颈效应、群体收缩或者是平衡选择导致。无论是在家蚕群体,还是野桑蚕群体,所有黑色素合成途径基因Fay and Wu'sH检验都不显著,这表明各基因都不存在由于搭载效应引起的高频率的等位基因过量。 家蚕和野桑蚕黑色素合成途径8个基因的连锁不平衡分析结果显示,家蚕和野桑蚕黑色素合成途径基因的连锁不平衡曲线在200 bp内呈快速降低趋势,而在200 bp以上的距离连锁不平衡曲线降低极为缓慢；野桑蚕黑色素合成途径基因的r2值在200 bp内快速降低至0.22,并在1600 bp内降低至0.10,而家蚕黑色素合成途径基因的r2值在200 bp内快速降低至0.54,并始终大于0.40。总之,家蚕黑色素合成途径基因的连锁不平衡程度要高于野桑蚕,表明家蚕由于驯化的影响,黑色素合成途径基因的重组率低于野桑蚕。 4.家蚕驯化过程中TH基因受到人工选择的证据 综合本研究的结果,我们可以发现,TH基因的确是家蚕驯化过程中人工选择的靶基因,其主要证据如下：首先,与野桑蚕相比,家蚕TH基因的核苷酸多态性降低了90%,序列分析的结果也显示,在野桑蚕大多数多态性位点处,家蚕不呈现多态性,而且是其中的一种野桑蚕单倍型在家蚕中得到了固定；其次,中性检验的结果表明,无论Tajima's D值还是Fu and Li's D值都小于0,统计检验也都表明家蚕TH基因显著偏离中性进化的模型,这意味着TH基因可能受到了定向选择的作用或者发生了群体扩张;第三,溯祖模拟的结果也表明,家蚕TH基因显著偏离瓶颈效应的模型,可能是驯化选择的靶基因；第四,TH基因的单倍型网络结构与系统发生分析结果表明,所有的家蚕样本能聚类在一起形成一个单独的cluster,而与野桑蚕样本明显地区分开来；第五,研究结果证明家蚕TH基因的核苷酸多态性的降低并非由瓶颈效应导致；第六,Fay and Wu's H检验以及TH基因连锁区域多态性比较等结果表明,家蚕TH基因并没有受到搭载效应的影响。因此,人工选择作用于TH基因,而不是其连锁区域。 进一步分析发现,家蚕和野桑蚕TH基因多态性差异区段主要位于非编码区,尤其是内含子区域,而侧翼区以及CDS区域,多态性差异相对较小。共发现4个种间固定位点,前两个固定位点位于第一内含子,第三固定位点位于第二内含子,最后一个固定位点位于外显子上,但密码子CCA突变成密码子CCG并没有造成氨基酸的改变,碱基突变属于同义替换。转录因子识别位点预测结果发现,野桑蚕群体中第一个固定位点存在一个Abd-B及同源HOX蛋白的识别位点(TTTAT),而在家蚕群体中,全部突变成了TTTAA;在第二个固定位点处,野桑蚕群体具有视黄醇类X受体(RXR)异源二聚体结合位点核心序列GGTC,但在家蚕群体中突变成了GGCC而丧失结合能力；但是,在第三个固定位点处,尽管碱基由野桑蚕中的C突变成家蚕中的G,并没有发现附近有转录因子识别位点的获得与丢失。迄今为止,尚未有RXR异源二聚体结合位点与昆虫体色形成相关联的研究报道,因此,我们重点关注了第一个固定位点处转录因子识别位点的变化。 为了进一步鉴定家蚕驯化过程中TH基因第一内含子Abd-B识别位点是否真正发生了突变,我们扩大了家蚕和野桑蚕的群体。我们对另外的60个家蚕样本和7个野桑蚕样本TH基因第一内含子Abd-B识别位点区段进行了克隆测序,测序结果表明所有的野桑蚕样本都含有Abd-B识别位点TTTAT,而所有家蚕样本中该基序都突变成了TTTAA。 先前的研究表明,Abd-B能通过与识别位点(TTTAT或TTTAC)相结合,增强yellow基因的表达,进而促进雄果蝇第5和第6腹节黑色素的生成,相反,Abd-B识别位点的突变失活会直接导致雄果蝇第5和第6腹节黑体色性状的丢失。因此,本研究通过荧光定量PCR分析家蚕和野桑蚕3个主要发育时期(幼虫、蛹及成虫)TH基因的相对表达量,结果表明,无论是幼虫、蛹还是成虫期,家蚕TH基因的相对表达量都要显著低于野桑蚕(Student's t-test, P0.0001),这与家蚕相对于野桑蚕呈现的浅体色是完全一致的。而酪氨酸羟化酶(TH)是昆虫黑色素合成途径的限速酶,其活性的强弱直接影响昆虫的体色。 综上所述,我们推测,TH基因第一内含子中一个可能的增强子元件(Abd-B转录因子识别位点)的突变,可能导致家蚕TH基因表达水平的显著降低,进而造成家蚕在驯化过程中体色的变浅。因此,本研究的结果强调了基因表达调控在驯化动物形态性状转变中的特殊作用。