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金盏菊再生体系的建立和遗传转化初探

张霞  
【摘要】:金盏菊(Calendula officinalis L.)为菊科金盏菊属植物,一年生或越年生草本。金盏菊原产欧洲,在欧洲栽培历史较长,广泛用于家庭小花园和盆栽观赏。在城市街旁的栽植槽和零星墙角花坛中,金盏菊是早春主角之一。我国金盏菊的栽培,是18世纪后从国外传入的,新中国成立后,金盏菊在园林中广泛栽培,应用于盆栽观赏和花坛布置。20世纪80年代后重瓣、大花和矮生金盏菊引入我国,金盏菊的面貌焕然一新,现已成为我国重要草本花卉之一。除了作为园林观赏花卉以外,金盏菊还是一种很有发展前途的经济植物,可作为很好的化妆品、药品等。但金盏菊特别容易遭受虫害,尤其是在早春花期,这就在一定程度上制约了金盏菊的应用和推广。通过根癌农杆菌介导的方法,将胰蛋白酶抑制剂基因Cpkti转入金盏菊基因组中,培育出具有抗虫功能的新品种,并为利用转基因技术改良金盏菊品种的广泛运用打下基础,对金盏菊在全国大面积推广应用,更好的为园林绿化服务具有重要意义。 本研究以金盏菊叶片外植体为供试材料,初步探讨了金盏菊再生体系和根癌农杆菌介导的遗传转化的体系。其主要研究结果如下: 1金盏菊再生体系的建立 以金盏菊的幼嫩叶片为外植体,以MS为基本培养基,通过添加不同浓度的6-BA和NAA设计不同的培养基,研究金盏菊叶盘的最适分化条件。从而初步建立了金盏菊的再生体系。叶片表面灭菌方式为:先75%乙醇浸泡30s,然后0.1%升汞浸泡10 min。愈伤组织诱导培养基为:MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+3%蔗糖+7 g/L卡拉胶,愈伤组织诱导率高达100%;分化培养基为:MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+3%蔗糖+7 g/L卡拉胶,分化率可达90%,繁殖系数为4.5。生根培养基为:1/2MS+NAA 0.1mg/L+3%蔗糖+7g/L卡拉胶,经过12天左右可诱导出根,生根率可达100%。 2金盏菊遗传转化体系的初步研究 在建立了金盏菊再生体系的基础上,对金盏菊进行了抗生素的敏感性试验,结果表明:金盏菊对卡那霉素比较敏感,培养基中添加10 mg/L卡那霉素,能抑制叶盘分化,培养基中添加10 mg/L卡那霉素,无菌苗难以生根。因此,10 mg/L卡那霉素可以作为筛选培养基中的抗生素配方;实验表明,500-300mg/L浓度的羧苄青霉素能有效的抑制农杆菌的生长,而且几乎不影响叶片外植体的再生率和不定芽数,可作为金盏菊的抑菌性抗生素。 以金盏菊无菌苗的叶片作为外植体,并利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将胰蛋白酶抑制剂基因Cpkti转入金盏菊中,对影响转化效率的因素进行了初步研究,探讨了预培养时间,农杆菌菌液浓度,侵染时间,共培养时间,以及延迟筛选时间对金盏菊遗传转化的影响。结果表明以上因素是农杆菌介导的金盏菊遗传转化的重要影响因素。优化后的遗传转化体系为:将第二次活化后OD600值为1.0的农杆菌菌液离心后收集菌体,加入液体MS+AS 100um/L +MES 0.1%(PH=7.0),重悬到OD600值为0.4-0.5。将预培养2d的叶盘置于重悬后的菌液中侵染15min,在MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L的共培养基中,暗培养2d;振荡脱菌30min后,在分化培养基中延迟培养2d,按5 mg/L-10 mg几卡那霉素逐渐递增的方式连续筛选直至有不定芽生成。羧苄青霉素的浓度开始时为500mg/L,后期为300mg/L。抗性芽在添加10mg/L卡那霉素的生根培养基中进行生根培养。对所得抗性植株进行GUS瞬时表达检测和PCR扩增检测表明:胰蛋白酶抑制剂基因已成功转入金盏菊中。


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