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蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-1的克隆及功能初步分析

秦楠  
【摘要】:病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PRP)是植物在受到一些化学物质的诱导、盐害、病原物(如真菌、细菌、病毒)的侵染等逆境胁迫时发生一系列防卫反应时产生出一些新的蛋白质。迄今为止,随着研究的不断深入,已经在30多种植物中诱发到了病程相关蛋白并得到了克隆。PR蛋白可分为PR-1、PR-2、PR-3、PR-4等共17类。其中PR—1家族在受病原或水杨酸诱导的PR蛋白中占据着统治地位,植物PR-1在结构上具有高度序列保守性。 在已有的研究基础上,从蜡梅cDNA文库中克隆了一个蜡梅病程相关蛋白1基因,并对基因的编码蛋白进行生物信息学分析及功能初步预测,通过构建植物表达载体,利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草,对转基因烟草进行胁迫研究,分析PR-1蛋白基因的功能。主要研究结果如下: 1.CpPR-1及编码蛋白的生物信息学分析 在已经构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过文库cDNA全长测序,得到了大小为得到其全长为1199bp,包含1个486bp的ORF,编码蛋白由161个氨基酸残基组成,其中碱性氨基酸14个,酸性氨基酸21个,无内含子的存在。 2.植物表达载体的构建 将该基因的的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,经过酶切和PCR验证,成功构建了克隆载体pCAM-CpPR-1.为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。 3.对烟草的遗传转化 通过农杆菌介导将含有蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-1的植物表达载体转入野生烟草中,经过GUS染色,Km+抗性筛选检测,和转化烟草]ONA PCR检测,获得转基因植株含CpPR-1基因的的有11株。4.转基因植株的胁迫分析 50mM CuS04处理5天后对照和转基因植株生长状况出现明显差异,野生型植株严重萎蔫,转基因植株生长基本正常,有轻微萎蔫症状,初步说明蜡梅PR-1基因可能具有抗重金属胁迫的功能。接种烟草花叶病毒7天后,转基因烟草和野生型烟草均出现一定的感病症状,枯斑大小及数量无明显差异,这表明烟草PR-1基因的表达对TMV病毒无明显抗性。


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