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南方鲇血细胞MPO细胞化学特征与cDNA克隆及表达分析

赵娜  
【摘要】:运用血细胞常规染色和酶细胞化学染色方法,研究了南方鲇血细胞髓过氧化物酶(MPO)的细胞化学特征,并对鲇形目、鲤形目等鱼类与四足类的血细胞POX染色特征进行比较;运用RT-PCR和RACE技术克隆南方鲇MPO全长cDNA序列,并运用RT-PCR方法研究MPO的组织分布和个体发生。对南方鲇血细胞MPO细胞化学特征和血细胞形态发生中MPO含量变化规律进行描述和总结,对脊椎动物系统发生过程中MPO和EPO的发生规律和真骨鱼类MPO基因在脊椎动物POX基因家族中的进化地位进行总结,获得南方鲇MPO的组织分布和个体发生中的时间表达模式。意义在于丰富鱼类血细胞的酶细胞化学研究资料,为进一步研究鱼类MPO基因在造血发育调控中的作用提供参考资料。 MPO特定存在于南方鲇嗜中性粒细胞中,可作为南方鲇嗜中性粒细胞的标志酶类。对几种鲇形目和鲤形目鱼类血细胞的MPO细胞化学特征进行比较,发现鲇形目鱼类血细胞中的MPO活力显著高于鲤科鱼类,推测鲇形目鱼类较强的抗病能力与嗜中性细胞中较强的MPO活力有关。 MPO在南方鲇早幼粒细胞阶段开始出现,到晚幼阶段含量逐渐增多,成熟嗜中性粒细胞中含量有所减少。在粒细胞发生中,MPO含量呈现先增加后减少的变化规律。比较南方鲇与其他脊椎动物血细胞发生中MPO含量变化规律,结果显示南方鲇中MPO的发生规律和多数鱼类、哺乳类相似。对比南方鲇与其他脊椎动物外周血细胞的POX染色特征,发现南方鲇的MPO细胞化学特征与两栖类、爬行类和哺乳类的较为相似,与鸟类的差异较大。推测在脊椎动物系统发生过程中,MPO和EPO的变化规律可能预示二者在功能上可互补。 南方鲇MPO基因cDNA全长为3356nt,开放阅读框(ORF) 2355nt,编码784个氨基酸,5’非编码区(5’UTR)含45nt,3’非编码区(3’UTR)含956nt。南方鲇MPO的AA序列包含信号肽(M-1-S24),一段前导肽(E25-P139),轻链(C140-G254)和重链(I255-K784)几个部分。南方鲇MPO与斑点叉尾鲴的同源性最高,达77%;其次为斑马鱼。南方鲇MPO的催化残基与其他脊椎动物的催化位点高度保守,Ca2+结合位点与其他脊椎动物的较为保守,3个N-糖基化位点与人的有差异,血红素环境与人的有较高相似性,但略有不同。推测南方鲇的MPO蛋白的催化机制与活性可能与哺乳类相似。 系统进化关系结果显示,真骨鱼类MPO基因是自鱼类从脊椎动物主干上分化出来后单独进化的,且与四足类EPO和MPO基因有共同的祖先。推测四足类MPO. EPO、LPO和SPO基因的分化时间晚于真骨鱼类与四足类的共同祖先。可能TPO最先从真骨鱼类POX基因家族中分化出来,其次是EPO,伴随真骨鱼类嗜酸性粒细胞吞噬功能的退化,EPO基因逐渐丢失。最后真骨鱼类的MPO基因分化出来,伴随嗜中性粒细胞吞噬功能的进化,MPO基因在不同类群的真骨鱼类中保留下来。 南方鲇MPO在不同组织中广泛表达,且在肾脏、头肾、皮肤、鳃等组织高量表达,MPO在不同组织中的泛表达模式与MPO参与机体非特异免疫的功能相符。南方鲇MPO基因在胚胎处于尾芽游离期开始表达,至心脏初现期,表达水平显著增加;至出膜前期,表达水平最高;至初孵仔鱼期,表达水平稍有下降;从出膜后到腹鳍和背鳍出现期,表达水平稍高于初孵仔鱼期,表达量之间无显著变化。MPO基因在胚胎发育中的时间表达模式说明南方鲇MPO的表达与造血系统发育密切相关。


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