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三峡库区土壤来源真菌SXW-05的分离鉴定及其活性产物的初步研究

李琴  
【摘要】:研究背景:近年来,随着各种抗生素的广泛应用,病原微生物的耐药问题日趋严重,寻找新型有效抗生素刻不容缓;抗肿瘤药物虽种类繁多,但其毒副作用、高昂成本也迫使人们去寻找新型有效抗肿瘤药物,因此国内外科研工作者正从天然产物中积极探索、寻找活性先导化合物。真菌特有的遗传背景和生物合成途径,使其次级代谢产物极为丰富,成为筛选新型抗菌药物的和抗肿瘤活性先导化合物的重要来源。自第一个广谱抗生素—青霉素问世以来,从真菌中寻找具有生物活性、结构新颖的次级代谢产物的研究长期受到生物医药工作者的重视。 三峡库区地处四川盆地与长江中下游平原的交界处,巫山地处三峡库区腹心,属于亚热带季风湿润气候,雨量充沛,独特的喀斯特地貌和明显的立体气候特征使巫山地区土壤蕴藏着丰富的微生物资源,各种微生物可能因环境的特殊而代谢多种活性次级代谢产物,成为新药筛选中重要的先导化合物来源。 研究目的:本文从三峡库区巫山土壤样品中分离培养真菌,经过抗菌活性、抗癌活性筛选后,选择活性抗菌谱广、活性较强的菌株作为研究对象,对其次级代谢产物进行初步研究,以获得活性产物,寻找先导化合物,丰富三峡库区天然药用先导化合物的来源。 研究方法:本文对采集的土壤样品进行处理后,利用平板稀释法进行真菌的分离培养;对所得到的真菌菌株采用牛津杯双层平板法和MTT法,以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为受试细菌,结肠癌细胞SW480为受试细胞,进行抗菌活性和抗癌活性筛选;对菌株SXW-05在三种鉴定培养基(PDA培养基、查氏培养基、马丁培养基)上的菌落培养特征、显微形态特征的观察及18S rDNA序列测定和系统发育分析,结合真菌鉴定手册(魏景超)综合判断,确定该菌株的种属地位;以PDA液体培养基中25℃,210r/min发酵8天后所得产物用乙酸乙酯充分萃取,浓缩成浸膏,采用用薄层层析、柱层析、高效液相色谱、重结晶等分离方法结合活性追踪对其活性产物进行分离纯化;利用质谱、紫外、核磁共振等波谱手段对所得活性单体进行结构鉴定;采用MTT法对单体进行抗肿瘤活性评价,以宫颈癌Hela、结肠癌细胞SW480为受试细胞,测定该化合物对这两种癌细胞的增殖抑制率,对活性单体抗肿瘤活性的实现初步评价。 研究结果:本文从三峡库区巫山土壤样品中共分离获得形态各异的真菌20株。经活性筛选后发现一株发酵产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)均有明显抑制作用,并且对结肠癌细胞SW480表现出抑制活性的菌株,将其作为为最终研究的目标菌株,并命名为SXW-05。经过菌落形态、显微形态观察,菌种鉴定后,确定该菌株与土曲霉Aspergillus terreus同源性最高,为98%,并且与Aspergillus terreus FJ878634.1处于同一分支,亲缘关系最近。对菌株SXW-05进行菌落观察时,发现在PDA固体平板上生长情况最为良好,因此最终确定该菌侏的发酵条件为:PDA液体培养基中25℃,210r/min发酵8天,经过乙酸乙酯充分萃取后得到浸膏5kg,将其分离纯化后最终得到一个有抗肿瘤活性单体FB44,对其结构鉴定后确定该化合物为4,5-二羟基-3-丙烯基-1-环戊烯基-1-酮,与文献报道的terrein结构一致。对单体FB44进行抗肿瘤活性评价,以宫颈癌Hela、结肠癌细胞SW480、肺癌细胞A549为受试细胞,测定化合物FB44分别对两种癌细胞的增值抑制率,测定其IC5o值分别为0.03mM、0.23mM、9μM,表现出良好的抗肿瘤活性。 结论:本文最终从三峡库区土壤分离到具有抗肿瘤活性的真菌Aspergillus terreusSXW-05,并得到其主要代谢产物之一化合物4,5-二羟基-3-丙烯基-2-环戊烯基-1-酮,为后续研究该化合物其他生理活性以及活性机理奠定了基础,丰富了三峡库区天然药用先导化合物的来源。


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