收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

一种绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆、表达及其特性分析

辛静  
【摘要】:本文以金龟子绿僵菌蝗变种(Metarhizium anisopliae var. acridum) CQMa102菌株的总RNA为模板,以RT、1P5和1P3、2P5和2P3为引物,在体外通过RT-PCR的方式成功克隆出了该菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表达基因序列。将该基因片段克隆到表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,并用0.5%的甲醇对其进行诱导培养。对诱导培养144h后的粗酶液进行SDS-PAGE和酶特性分析,结果表明重组PD在毕赤酵母中表达出了酪氨酸蛋白磷酸酶。有研究已经表明,该酶在体外能改变其寄主(蝗虫)血淋巴中与信号传导相关的蛋白(Toll-like receptor)的磷酸化状态,进而可能干涉寄主体内免疫活动。因此,本研究将为从蛋白水平分析绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶对蝗虫体液免疫防御的影响和探讨病原真菌干扰寄主体液免疫的可能机制提供物质基础。 全文的主要结论如下: 一、绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆 根据绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的已知序列设计引物,从绿僵菌的总RNA中扩增出一条1900bp左右的基因片段。将该基因片段和pMD19-T质粒连接,转化感受态大肠杆菌,结合PCR方法筛选阳性克隆。其基因片段的序列分析结果表明该基因片段共1960bp,含有引物中的2个EcoRl酶切位点和6个组氨酸标记;而且该基因片段中含有绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表达基因,可编码一个含647个氨基酸的蛋白质,该蛋白质氨基酸序列中还包含酪氨酸蛋白磷酸酶质谱测序获得的有5段肽段氨基酸序列即:DITNFFGVKEPEVEK, WYEDLFAEDK, GNDSALDLPGLK, NIQYGTGVNFPSNWEPR, ALGDLLEELDDTVR;证明克隆正确。 二、毕赤酵母的表达重组载体的构建 根据毕赤酵母表达系统的特点和要求,选用pPIC9K质粒载体连接目的基因,转化感受态大肠杆菌,结合PCR方法筛选阳性克隆。阳性克隆的测序分析结果表明目的基因已经插入pPIC9K质粒的开放阅读框内,且目的基因的5’端连接在pPIC9K质粒的信号端,证明目的基因的毕赤酵母表达重组载体已经构建成功。 三、目的基因的整合及其高效表达菌株的筛选 用电转化法将构建的毕赤酵母重组载体转化感受态毕赤酵母KM71,并结合遗传霉素抗性和PCR方法筛选阳性克隆。挑取不同遗传霉素抗性的阳性克隆进行甲醇诱导表达,对不同时间段的培养液进行透析、pNPP底物的相对酶活性测定。其培养液相对酶活性测定的分析结果表明,抗遗传霉素浓度为3.0mg/ml的14号菌株的培养液相对酶活性明显高于其他菌株,且该菌株培养144h时的培养液相对酶活性最高,证明14号菌株有可能高效表达目的蛋白。 四、粗酶液的SDS-PAGE及其酶特性分析 粗酶液经过SDS-PAGE分析得到一条75.6KDa的蛋白质片段,与目的基因表达的酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量大致相同。酶底物特异性分析表明粗酶液中的磷酸酶对磷酸酪氨酸残基的专一性较强,Cu2+可明显抑制该粗酶液对8mM PNPP的水解作用,Ca2+可促进该粗酶液对8mM pNPP的水解作用,而Mg2+、Ni2+、Mn2+对该粗酶液水解8mM PNPP的活性影响不明显;而且丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶专性抑制剂NaF、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶抑制剂EDTA对磷酸酶酶解pNPP活性没有明显的抑制作用,酸性磷酸酶的特异性抑制剂酒石酸钠也对该粗酶液酶解pNPP活性影响不明显;但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂钼酸钠和钨酸钠显著抑制酶对pNPP的酶解活性,证明目的基因表达的蛋白质是酪氨酸蛋白磷酸酶。该粗酶液对8mM pNPP底物的最适作用温度为60℃,而对8mM O-phospho-L-tryosine底物的最适作用温度为55℃。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 徐立红,张甬元,陈国胜,徐盈,原田健一;鱼肝中蛋白磷酸酶的分离纯化[J];水生生物学报;1995年04期
2 ;基因诱变、重组、克隆[J];生物技术通报;1993年08期
3 沙莉;苏争先;黄小红;邱君志;关雄;;微生物几丁质酶的分子生物学研究及其应用[J];农业生物技术学报;2003年06期
4 王静敏,魏峰,张西臣,蔡亚男,刘全,吴涛,李建华,尹继刚;柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析[J];吉林农业大学学报;2005年04期
5 许崇波,王玉炯,许崇利;C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆与表达[J];生物技术;2005年05期
6 陈吉祥,杨慧,颜显辉,钟英斌,张晓华,李筠;致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测[J];中国水产科学;2005年05期
7 陈选阳;林世强;袁照年;张招娟;郑金贵;;甘薯zds基因的克隆与植物表达载体构建[J];福建农林大学学报(自然科学版);2005年04期
8 李落叶;井金学;;稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆[J];中国农学通报;2006年01期
9 杜金友;孟宪强;徐兴友;王同坤;郭学民;;植物耐盐相关基因克隆与基因工程的研究进展(综述)[J];河北科技师范学院学报;2006年01期
10 崔昌华;吴伟怀;郑肖兰;;植物病原镰刀菌属突变技术及相关基因研究进展[J];华南热带农业大学学报;2006年01期
11 谭小军;黄志平;李蔍芸;聂东宋;钟锠高;傅俊江;卢光琇;;一个人类精子发生相关新基因TSARG7的克隆和初步功能研究(英文)[J];遗传学报;2006年04期
12 郝春燕;李建国;李雅轩;晏月明;;小麦醇溶蛋白基因克隆研究进展[J];首都师范大学学报(自然科学版);2006年02期
13 王燕;汪以真;;猪激素敏感脂酶基因克隆与序列分析[J];中国兽药杂志;2006年05期
14 余贤美;李锐;郑服丛;;水稻CO39β-l,3-葡聚糖酶基因的克隆[J];热带作物学报;2006年02期
15 章振华;周雪媚;谌南辉;陈小玲;罗长保;李永清;;鸡补体分子C3d的基因克隆及结构分析[J];生物技术通讯;2006年04期
16 宋凯;宋继梅;张涌;;小鼠Oct4基因的克隆及其原核表达载体的构建[J];西北农业学报;2006年05期
17 张淑霞;贺秀媛;崔保安;王建华;;鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因的克隆与序列分析[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2006年11期
18 陶红梅;罗立廷;朱婷婷;杨广笑;何光源;;中国春小麦puroindoline a基因的克隆及其真核表达载体的构建[J];生物技术通讯;2007年03期
19 林同;李立娜;常润磊;张宇宏;;橄榄星室木虱乙酰胆碱酯酶基因的克隆与序列分析[J];吉林农业大学学报;2007年04期
20 马玉银;潘存红;左示敏;张亚芳;陈宗祥;潘学彪;;T-DNA标签技术及其在水稻基因克隆中的应用[J];江苏农业科学;2007年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 滕铁山;谢建平;;结核分枝杆菌中蛋白磷酸酶的研究进展[A];重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2009年
2 王建华;吴建平;费春红;杨联;张利平;;牦牛钙激活蛋白酶抑制蛋白CAST基因克隆及其测序分析[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
3 孙玲;余少波;刘榜;;猪Nudt6基因克隆以及与眼肌面积性状相关SNP发现[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
4 戴佳琳;吴璇;黄江;杜武英;胡旭初;徐劲;余新炳;;亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2008年
5 朱炎平;邱君志;关雄;;粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)几丁质酶基因克隆的研究[A];中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集[C];2006年
6 吕海鹏;史俊南;赵守亮;Athony J.Smith;;人成牙本质细胞样细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的表达、纯化和多克隆抗体的制备[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
7 王玮;杜艳;林国强;孙秉中;;RNA干涉bcr abl融合基因联合P27基因克隆对K562细胞的影响[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
8 方卫国;肖月华;冷波;杨星勇;张永军;裴炎;;一种新的球孢白僵菌几丁酶Bbchit1的纯化和基因克隆[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
9 张志春;张谷丰;罗光华;方继朝;;小菜蛾嗅觉膜原蛋白SNMP1基因的克隆表达[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
10 王翠;李世军;李闯;俸艳萍;彭秀丽;龚炎长;;鸭多巴胺受体1(DRD1)基因克隆与多态性检测[A];安全优质的家禽生产——第十五次全国家禽学术讨论会论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李志勇;调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
2 谢科;水稻WRKY10基因的功能研究[D];浙江大学;2005年
3 邢继红;拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D];河北农业大学;2006年
4 魏继承;白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆[D];东北林业大学;2006年
5 赵明莲;食线虫真菌侵染性胞外蛋白酶的基因克隆与表达[D];云南大学;2003年
6 郭虹;弓形虫侵入相关分子ROP1基因的克隆及其DNA免疫研究[D];中山医科大学;1999年
7 王昕;巨噬细胞集落刺激因子可溶性受体的克隆表达及其相关性研究[D];中国协和医科大学;1998年
8 李伟;圆锥小麦地方品种遗传多样性研究[D];四川农业大学;2006年
9 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
10 倪多娇;栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 辛静;一种绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆、表达及其特性分析[D];西南大学;2011年
2 刘艳梅;玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
3 鲍鸣;鸡IFN-γ基因的克隆与原核表达[D];安徽农业大学;2005年
4 刘占通;猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究[D];河南农业大学;2005年
5 张怡;重组鼠抗人CD19单链抗体的构建和表达[D];浙江大学;2006年
6 郝敏;玉米与大斑病菌构成的不同互作中基因表达的研究[D];河北农业大学;2006年
7 黄志强;产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其基因克隆[D];福建农林大学;2006年
8 武鸿;嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D];浙江大学;2007年
9 余国武;腊梅脂转移蛋白基因克隆与功能的初步分析[D];西南大学;2007年
10 赵秀振;蓖麻蚕体液胰凝乳蛋白酶抑制剂调查及其基因克隆[D];中国农业科学院;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 李秀萍;石河子大学转基因克隆绵羊研究取得突破[N];兵团日报(汉);2011年
2 刘越西 徐仁元 记者 金姝;世界首例赖氨酸转基因克隆奶牛在吉大农学部培育成功[N];吉林日报;2011年
3 黄勇娣;世界首例转基因克隆兔在沪诞生[N];解放日报;2007年
4 许沈华;什么是基因克隆[N];家庭医生报;2007年
5 曹斌;血癌新病毒基因克隆成功[N];团结报;2000年
6 王婷婷;我国完成世界首例转基因克隆兔实验[N];科技日报;2007年
7 王有佳;全球首例转基因克隆兔在沪诞生[N];人民日报;2007年
8 李建平;首例荧光转基因克隆猪所产猪崽再次被确认具有荧光特征[N];大众科技报;2008年
9 记者 王中宙;25只转基因克隆绵羊在内蒙古农业大学诞生[N];呼和浩特日报(汉);2010年
10 吴一福;四军医大构建HBV全基因克隆质粒细胞系[N];中国医药报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978