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家蚕Sox基因的鉴定和功能研究

魏玲  
【摘要】:Sox基囚家族是一类只在动物个体中存在的与动物性别决定基因Sry (sex determining region of Y chromosome)具有高度序列相似性的转录因子家族,含有一个高度保守的与DNA结合相关的高迁移率族盒(high mobility group box, HMG-box)结构域。最近,小鼠、果蝇等模式生物中的大量研究表明,Sox基因主要参与调节动物性别分化及生殖腺发育、早期胚胎发育、神经系统发育以及软骨和多种组织器官的形成等多种生物学过程。 家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫研究的模式生物。家蚕胚胎发育、性别决定以及部分组织器官(如丝腺、生殖腺和脂肪体)的分化发育是家蚕生物学研究的重要领域。Sox基因家族应该可以成为研究这些家蚕生物学问题的靶标之一,相关研究成果不仅可以用来改良家蚕性状,也可以为鳞翅目害虫的生物防治提供理论依据和关键作用靶标。 借鉴果蝇和其它物种中Sox基因的研究成果,利用家蚕基因组精细图和基因芯片等数据资源,我们对家蚕Sox基因进行了鉴定,调查了Sox基因的时空表达谱,并在细胞水平和个体水平分析了SoxE基因的功能。获得的主要研究结果如下: 1.家蚕Sox基因的基因组水平鉴定及表达模式分析 利用Sox蛋白保守的HMG盒(HMG box)结构域序列来对家蚕基因组序列进行同源性检索,最后在家蚕基因组中鉴定获得了9个Sox基因,分属5个亚族,其中B族Sox基因包含5个成员,C、D、E、F族各有1个成员。利用家蚕SNP分子标记遗传连锁图谱,我们将所鉴定的所有家蚕Sox基因都定位到了染色体上。其中,B族的5个成员,即BmSox21a、BmSoxB3、BmDichaete、BmSox21b和BmSoxNeuro都位于4号染色体上,而且BmSox21a、BmSoxB3、BmDichaete和BmSox21b串联排列在scaf2589重叠群的268 kb区域内,与其它昆虫B族Sox基因的染色体分布特征类似:其它Sox基因散在地分布在不同的染色体上。进一步对家蚕Sox基因完整HMG盒中的内含子数目进行比较发现,家蚕有5个Sox基因的HMG盒没有内含子,包括BmSoxC、BmSoxD以及BmSox21a、BmSoxB3和BmDichaete等3个B族成员;B族BmSoxNeuro基因的HMG盒中有2个内含子;BmSoxE的HMG盒中只含1个内含子。 调查40个不同地理分布的家蚕和野桑蚕个体基因组中Sox基因内的SNP数量发现,家蚕群体内每个Sox基因中的SNP数量为4-32个,而野桑蚕群体内每个Sox基因中的SNP数量为5-26个。对同一个Sox基因而言,其SNP数目在家蚕和野桑蚕群体中比较相近。如果同时比较40个蚕的基因组序列,可以发现每个Sox基因在40个蚕基因组中的SNP数量与此近似,从6至33个不等。SoxB3、Dichaete、SoxC和SoxD中的SNP频率较高,而Sox21a、Sox21b、SoxB3、Dichaete、SoxE和Sox F等6个基因编码区的部分SNP可导致非同义替换,但只有Sox21a、SoxE和SoxF等3个基因中分别有1个SNP位点位于HMG盒。另外,应用PAML程序包分析家蚕和野桑蚕Sox基因中的SNP数据发现,SoxB3和SoxD在家蚕驯化过程中受到了正选择压力。 基于家蚕及其它昆虫Sox蛋白HMG-box序列的多序列比对结果,我们构建了家蚕及其它昆虫Sox基因的系统发生树,并发现所有昆虫的SoxC、SoxD和SoxF三个族都能很好地各自聚成1个分支,而B族(Dichaete、Sox21a、Sox21b、SoxB1、SoxB2和SoxB3)及E族(SoxE1和SoxE2)各个成员之间的聚类较差。综合分析基因数量、染色体分布、HMG盒中的内含子数以及系统发生树,推测家蚕及其它昆虫中SoxC、SoxD和SoxF起源于昆虫分化之前,B族和E族Sox基因的复制分化是在昆虫相互分化之后发生的。 利用RT-PCR检测Sox基因在家蚕胚胎发育过程中的表达模式发现,BmSox21a、BmSox21b、BmDichaete、BmSoxNeuro、BmSoxC和BmSoxF等6个基因在家蚕整个胚胎发育期都有表达,只是表达量有差异。其中,BmSox21a在产卵后120小时显著上调表达,BmSoxB3从产卵后144小时开始表达并一直持续到蚁蚕,BmSoxE从产卵后72小时开始表达并持续到产卵后216小时。由于家蚕大量组织器官主要在胚胎发育后期形成,我们推测胚胎发育后期上调表达的BmSox21a、BmSoxB3和BmSoxE可能与家蚕幼虫组织器官的形成相关。 通过分析家蚕幼虫5龄第3天各组织全基因组表达的芯片数据发现,只有BmSoxE基因在幼虫5龄第3天的卵巢和精巢中有表达,其它Sox基因在所有组织中都未检测到表达,暗示BmSoxE基因参与了家蚕生殖腺发育的调控。分析家蚕幼虫-蛹-成虫变态发育过程的全基因组表达芯片数据,我们发现只有4个Sox基因在家蚕变态发育过程中有表达,包括BmSoxB3、BmSoxNeuro、BmSoxC和BmSoxE。其中,BmSoxB3在上蔟后216小时的雄蛹及雄蛾中表达,BmSoxC在刚化蛹的雄蛹中表达,BmSoxNeuro和BmSoxE均在上蔟后96小时、144小时、168小时、216小时、240小时的雄蛹及雄蛾中表达。但是,BmSoxNeuro还在化蛹前后表达,即在上蔟后36小时、48小时和60小时的雄个体及上蔟后48小时和60小时的雌个体中表达。综合来看,Sox基因主要在家蚕变态发育的后期表达,推测其可能与家蚕蛹向成虫的转变调节有关。 2.家蚕BmSoxE基因的全长cDNA克隆及表达分析 我们利用RACE技术对BmSoxE基因的全长cDNA序列进行了克隆。结果显示,BmSoxE基因的完整cDNA序列全长为1398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白的氨基酸序列含有Sox蛋白家族典型的SOX-TCF_HMG-box结构域(48-116 aa)和数个磷酸化位点。 我们对BmSoxE基因的组织和时期表达谱进行了分析。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕幼虫5龄第3天精巢中的表达量最高,在卵巢中的表达量次之。时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,BmSoxE基因的表达一直维持在较高水平。分析BmSoxE基因在变态发育过程中不同发育时间点的精巢和卵巢中的表达谱显示,BmSoxE基因在精巢和卵巢发育过程中的表达存在差异,特别是在预蛹前后,BmSoxE基因在幼虫5龄第6天到上蔟后48小时的精巢中下调表达,但在同时期的卵巢中开始上调表达,推测BmSoxE在家蚕胚胎发育早期即开始发挥作用,并在预蛹前后的精巢和卵巢的发育中发挥了不同的功能。我们制备了家蚕BmSoxE蛋白的抗体,对BmSoxE蛋白在雄蛾精巢中的表达分布进行了免疫荧光组化分析。结果表明,BmSoxE蛋白只在雄蛾精巢部分细胞的细胞核中表达。 3. BmSoxE基因在家蚕BmN4细胞中的功能研究 将表达Venus荧光蛋白融合的BmSoxE基因质粒及其对照Dest质粒分别转染到BmN4细胞中,并在转染后72小时再向培养基中加入Hoechst溶液,对核DNA进行染色,之后观察并发现Venus融合的BmSoxE基因的表达产物定位于细胞核中。 我们合成了目标基因BmSoxE和对照基因EGFP的dsRNA,即dsBmSoxE和dsEGFP,分别加入细胞培养基中,在培养7天后再分别收集BmN4-SID1细胞,以期在细胞水平开展BmSoxE基因的RNAi研究。我们首先发现,与对照相比,在dsBmSoxE处理的BmN4-SID1细胞中,BmSoxE基因的表达明显被下调,几乎不能被检测到,表明该RNAi技术体系可以用于BmSoxE基因的功能研究。 用显微镜观察dsBmSoxE和dsEGFP处理7天后的BmN4-SID1细胞,发现dsBmSoxE处理后的细胞数量明显少于dsEGFP处理后的细胞。细胞增殖曲线分析表明,BmSoxE基因的RNAi会对细胞的增殖产生明显的影响。用流式细胞仪检测发现,BmSoxE基因RNAi后,G2期和M期的细胞数量明显减少,细胞主要滞留于细胞周期的G1/S期。这表明BmSoxE基因在细胞周期从G1期向S期的转化过程中具有重要的作用。 我们进一步用家蚕全基因组表达芯片对BmSoxE基因RNAi对BmN4-SID1细胞中基因表达的影响进行了分析。结果表明,BmSoxE基因RNAi后,BmN4-SID1细胞中有371个基因的表达发生了变化,其中142个基因下调表达,227个基因上调表达;差异表达基因中有233个基因(91个下调表达基因和142个上调表达基因)有同源功能注释,157个基因(66个下调表达基因和91个上调表达基因)的转录起始位点上游2000bp的区域内含有Sox蛋白HMG盒的识别位点。GO功能分析显示,BmSoxE基因RNAi后的差异表达基因主要具有催化和结合活性,参与了发育、代谢、着色等生物学过程,部分特异的下调和上调表达基因以及表达变化超过10倍的基因大部分与细胞增殖、细胞死亡、细胞分化等细胞命运决定事件紧密关联。 另外,我们发现在BmN4细胞中过表达BmSoxE基因对细胞增殖的促进作用较小。基于融合表达标签的Western杂交检测分析显示,过表达的BmSoxE基因在BmN4细胞中具有蛋白表达。 4. BmSoxE基因在家蚕个体中的功能初探 考虑到BmSoxE基因在家蚕雄性个体生殖腺即精巢中的表达量较高,我们进一步基于dsRNA介导的RNAi实验,对BmSoxE基因在家蚕雄性个体中的功能进行了研究。在家蚕预蛹及化蛹后2天连续分别注射BmSoxE(试验组)和红色荧光蛋白基因Red(对照组)的dsRNA,即dsBmSoxE和dsRed。结果发现,无论是注射40μg/头还是60μg/头的dsRNA,试验组和对照组的家蚕都可以正常地化蛹和化蛾,且都能与正常雌蛾交配。但是,观察交配后的雌蛾所产的卵发现,对照组(注射dsRed)在48小时后均能正常转色,而试验组(60μg/头)中有3个卵圈(dsSoxE60-18、dsSoxE60-21和dsSoxE60-23)未能正常转色,且不孵化,形成不受精卵。解剖对应亲本雄蛾并观察其生殖腺(包括内部生殖器)发育状态,发现其均存在不同程度的异常。dsSoxE60-18雄蛾左侧的输精管直接与外生殖器相连,并且射精囊一端也与外生殖器相连;dsSoxE60-21的贮精囊膨大呈囊泡状;dsSoxE60-23的附腺出现异常,其基部和靠近端部的区域埋在贮精囊中,形成一个环状,所以整个附腺不连续,暴露在外面的部分分成很短的端部和环状结构。这些结果都表明,BmSoxE基因可能与家蚕生殖腺发育及后代育性调节有关。


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