牛型布鲁氏菌苹果酸脱氢酶酶学性质及其免疫学特性研究

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患慢性细菌性传染病,该病在世界范围内广泛流行并严重危害着人畜健康。布鲁氏菌在宿主体内生存能力极强,在巨噬细胞内具有极强的繁殖能力以及防止杀伤的自我保护能力,但其不具有经典的毒力因子且不能引起强烈的先天性免疫,因而给布鲁氏菌的防治带来了很大的困难。体内诱导基因涉及病原菌在体内的生存和致病过程,本研究对本实验室筛选、鉴定的布鲁氏菌体内诱导抗原—苹果酸脱氢酶的酶学特性及生物学功能开展研究,探讨MDH在布鲁氏菌致病过程的机制。 本研究以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板,通过PCR技术扩增出牛型布鲁氏菌MDH的编码基因Malate dehydrogenase (mdh),测序结果表明,该基因大小为936bp,与NCBI上公布的布鲁氏菌2308(登录号：NC_007618.1)序列100%同源。PCR产物经酶切后与表达载体pET-28a(+)连接,成功构建pET-28a-MDH重组质粒,转化入大肠杆菌BL-21(DE3),经IPTG诱导表达后,成功表达大小约为36KDa的融合蛋白His-MDH。通过优化表达条件,His-MDH主要以可溶性方式表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6His-Tag标记,通过Ni+亲和层析柱成功对His-MDH进行纯化,为进一步研究该蛋白的酶学性质及免疫学特性奠定了基础。 苹果酸脱氢酶(MDH)是三梭酸循环中的一个关键酶,MDH以NAD+为辅因子,催化苹果酸盐与草酰乙酸盐的相互转化。本研究对表达、纯化的布鲁氏菌MDH的酶学性质进行了初步研究,结果表明：在体外催化苹果酸盐与草酰乙酸盐的酶促反应中,最适pH值为6.0,反应最适温度为42℃,在50℃以下酶的稳定性较好,Zn2+、Pb2+和Cu2+对酶有明显的抑制作用。酶动力学参数测得Km为0.67(mM),Vmax为0.91 (umol ml-1 min-1)。 生物信息学分析表明,该酶为四聚体,单体存在N一端的NAD结合区、催化区及C—端尾区三个结构域,同时也存在与底物结合位点,疏水结构易形成酶的口袋结构,通过对不同细菌MDH的酶学活性位点分析,对布鲁氏菌MDH可能存在的酶活位点进行预测。以重组质粒pET-28a-MDH为模板,采用重叠引物延伸PCR技术在布鲁氏菌mdh基因中分别引入六个点突变(R89L、D149V、R152L、H176P、D178V、A231V)后与表达载体pET-28a(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过诱导表达与纯化,成功获得六个点突变的重组MDH。通过对MDH酶学活性的比较测定,结果发现除D178V点突变对酶活基本无影响外,其它五个点突变都可以使酶活完全丧失。 Western Blot检测结果表明,重组His-MDH能与布鲁氏菌阳性牛血清发生特异性反应,表明MDH具有免疫原性。用His-MDH作为包被抗原,对临床收集的30份布鲁氏菌阳性牛血清进行ELISA检测,结果所有被检血清均为阳性反应,表明MDH可作为潜在的用于牛型布鲁氏菌感染诊断的靶蛋白。生物信息学对MDH的氨基酸一级序列抗原性、亲水性、表面可及性以及柔韧性等指标的分析,一共预测了8条B细胞线性表位。此外,对MDH的亚定位结果表明,MDH为膜相关蛋白；纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性分析以及布鲁氏菌感染的Hela细胞实验表明：MDH蛋白具有纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性,参与布鲁氏菌对宿主细胞的入侵过程。 本研究通过对布鲁氏菌苹果酸脱氢酶酶学性质以及免疫学特性研究,对阐述MDH参与布鲁氏菌致病过程中的作用提供依据,为进一步基于MDH在牛型布鲁氏菌在诊断、药物及疫苗研究提供理论基础。