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柑橘全爪螨不同品系转录组及基因表达谱差异分析

刘斌  
【摘要】:柑橘全爪螨是世界性柑橘害螨,对产量影响极大,同时也是常见哮喘和鼻炎的过敏源。柑橘全爪螨为多食性害螨,可取食柑橘,玫瑰,杏,梨,蓖麻等80余种植物。该螨由于历期短,世代多,繁殖力强,因而极易对杀螨剂产生抗性,目前已报道对绝大多数登记的杀螨剂产生不同程度的抗性。基因组信息极其匮乏严重阻碍了柑橘全爪螨抗性机理的深入研究。为了从分子水平上弄清其抗性机理,作者应用了新一代测序技术(I1lumina HiSeqTM2000)测定了柑橘全爪螨抗性品系和敏感品系转录组,在此基础上,运用数字基因表达谱技术比较了抗性品系和敏感品系基因表达差异。 1、柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系筛选 柑橘全爪螨采自中国农业科学院柑桔研究所多年未施药的枳橙苗上,经室内不接触药剂连续饲养3年视为敏感品系(LC5o为0.056μg/m1)。敏感品系用噻螨酮进行抗性筛选(选择压力为70%左右),经过20代连续汰选,获得抗性倍数为3532.12的噻螨酮抗性品系(LC5o为197.799μg/m1)。 2、柑橘全爪螨转录本数据组装 通过转录组测序,从柑橘全爪螨抗性品系和敏感品系分别获得了25,000,000和26,000,000个平均长度为90bp的净Reads。使用SOAPdenovo软件进行初步组装,在抗性品系中得到215,641条平均长度为178bp的contigs,在敏感品系中得到282,291条平均长度为151bp的contigs。利用成对Reads的拼接与填空,在抗性品系和敏感品系分别得到了38,178条平均长度为453bp的scaffolds和44,017条平均长度为406bp的scaffolds。Scaffolds进一步组装后,在抗性和敏感株系分别得到30,466条平均长度为536bp的Unigene和34,159条平均长度为489bp的Unigene。利用同样的方法,将混合reads组装成32217条Unigene。我们把混合Reads比对到nr,COG,KEGGE,GO数据库中,共有17581条基因得到了功能注释且E值小于等于1e-5,其中有7075条基因的到COG注释,12712条基因得到KEGG的注释,3812条基因得到GO注释,17457条基因得到nr注释。 3、常规杀虫剂抗性有关基因的签定及差异分析 从组装的Unigene中鉴定出200条与常规杀虫剂代谢抗性相关的基因,包括121条P450基因,30条谷胱甘肽S转移酶基因,43条羧酸酯酶基因,2条NADA脱氢酶基因和4条超氧化物歧化酶基因。根据P450相似性,对46条P450基因进行差异性分析(E值10-5)。基于Log2ration值,发现有9条P450基因,4条GST基因,3条羧酸酯酶基因和1条酯酶基因表达倍数差异大于2。表达倍数大于2的4条P450基因属于分支3且参与外源物质代谢通路(ko00982和ko00980),另外有1条上调的GST基因也参与外源物质代谢通路(ko00980)。 4、柑橘全爪螨不同品系生长发育相关基因及常规靶标基因的比较 基于噻螨酮作用机理,从柑橘全爪螨转录本中鉴定出105条与生长有关的基因,194条与生殖有关的基因。通过比较敏感和抗性品系的钠离子通道、GABA受体和生长发育相关基因的核酸序列,分别获得了24,12和23个SNPs。这些SNPs主要集中在G-A,T-C,C-T三种类型。 5、柑橘全爪螨不同品系基因表达谱分析 进一步通过测序和比较尼索朗抗性和敏感品系数字基因表达谱,得到了148条差异倍数大于2的基因和246条差异倍数大于1的基因。显著性分析表明有65条基因得到了GO富集分析,22条基因得到了Pathway富集分析。在这些显著差异表达基因中,发现Unigene21272_All,Unigene23131_All,Unigene25542_All共3个上调表达倍数最大的新转录本,他们的表达倍数依次为15.47,14.50,13.78。 据笔者所知,本研究是首次应用比较转录组的方法鉴定可能的螨类抗药性基因。通过比较分析,鉴定比较了与常规杀虫剂有关的基因以及与螨类生长发育相关的基因,同时通过表达谱分析得到差异最大的3条新转录本。这些数据为今后深入研究分子抗性机理提供了宝贵的基因资源。


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