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小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究

何允  
【摘要】:哺乳动物的早期性别鉴定是人为进行性别控制的手段之一。在畜牧业生产中,通过性别控制能够建立优化商品畜群,充分发挥母畜的繁殖能力及公畜的生长优势,提高畜产品经济效益,并能够在生产前排除潜在有害基因型,防止性连锁疾病;在分子生物学、胚胎细胞学及发育遗传学等基础学科的研究中,胚胎性别鉴定是探索胚胎发育机制、深化干细胞研究、实现肿瘤分子调控等热点研究课题的环节之一;胚胎成纤维细胞具有细胞体积大数目多、来源广泛且取材方便以及在体外培养条件下能够迅速生长繁殖,并且能够长期传代等优点,广泛应用于胚胎干细胞的分离与培养、体细胞克隆与核移植等课题的研究,因此小鼠早期胚胎及成纤维细胞的性别鉴定在畜牧生产、遗传育种、胚胎发育学及临床应用范围内均具有实用价值。本课题使用双重PCR法对小鼠附植前8-细胞胚胎以及小鼠胎儿成纤维细胞进行了性别鉴定,旨在探寻一种简便可靠的双重PCR性别鉴定方法,为小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植等研究提供参考。具体内容包括: (1)引物设计及其合理性检测:以雄性特异性SRY基因序列设计了一对特异性引物,即上游引物SRY250U:5’-CTTTTTCCAGGAGGCACAGA-3’及下游引物SRY250L:5’-GACAGGCTGCCAATAAAAGC-3’;以雄性及雌性共有的锌指结构ZFX基因序列设计另一对内标引物,ZFX399U 5’-AAGAGAGTCCATTCAAGTGTGA-3’为上游引物,ZXF399L: 5’-GCTACCTTTGTTGCCGAAAT-3’为下游引物;使用离心柱式动物基因组DNA提取试剂盒提取小鼠肝脏组织DNA基因组作为模板,在适宜的反应体系及条件下,分别用两对引物进行体外扩增,扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳进行结果检测。结果表明SRY基因引物对能够对雄性基因组扩增出约250bp的目标条带,雌性基因组扩增结果为空白,而ZFX基因引物对可对雄性及雌性小鼠肝脏组织基因组均扩增出399bp大小的目标条带;使用已知性别小鼠肝脏基因组为模板,同时用两对引物进行扩增,结果雄性小鼠扩增结果为内标条带及判断条带同时存在,而雌性小鼠扩增结果为399bp一个条带,说明试验所设计引物具备有效性及合理性; (2)将适龄健康的雌鼠注射PMSG和hCG后与雄鼠合笼,将见栓后2d的雌鼠进行无菌手术,取出子宫并以M2操作液冲洗,得到2.5d胚龄的胚胎。将所得胚胎经0.5%链霉蛋白酶于37℃处理30s去除透明带,M2操作液洗涤后,从每个8-细胞胚胎吸取4个卵裂球用于性别鉴定;将卵裂球加入8μL ddH_((2))O后以5μL石蜡油覆盖,恒温煮沸5mmin后-20℃冰浴5min,14000rpm离心2mmin,取上清液用于扩增,扩增体系为:ddH_((2))O7μl;10×Buffer 3μl;Mg~((2=))=2μl;10×Taq Buffer 2.5μl;dNTP 3μl;引物P11μl;引物P_((2)) 1μl;DNA样本5μl;Taq酶1.5μl;反应条件为:预变性94℃,5min;变性94℃,30s;退火60℃,35s;延伸72℃,40s,共30个循环;72℃,10min,4℃保存。扩增结束后取5μl产物在1.5%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对40枚小鼠附植前胚胎进行性别鉴定,结果显示其中20枚胚胎电泳检测扩增结果出现250bp大小的判断条带及399bp大小的内标条带,由此判断此20枚附植前胚胎为雄性胚胎;12枚8-细胞胚胎卵裂球提取DNA后进行体外扩增后,电泳结果显示399bp大小的内标条带,判断条带为阴性,因此判断为雌性胚胎;另有8枚胚胎因条带缺失或模糊不明无法进行性别判断。性别鉴定成功率为80.00%。 (3)将适龄健康的雌鼠注射激素后与雄鼠合笼,13d后将雌鼠处死进行无菌手术,摘取完整子宫并以取出13.5d胎龄的胎鼠用于分离MEFs;将所得MEFs的细胞密度调整至1×106个/ml,于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱中培养,每24h换液一次,待80-90%细胞贴壁时进行传代培养,并观察贴壁情况,得出F3代MEF贴壁及发育状况均优于其他代细胞;取第3代MEFs按离心柱型细胞基因组DNA提取试剂盒提取总DNA;使用自主设计的SRY基因引物及ZFX基因引物对MEFs DNA进行体外扩增,扩增体系为:ddH_((2))O 7μl;10×Buffer 3μl;Mg~((2=))2μl;10×Taq Buffer 2.5μl;dNTP 3μl;引物P1 1μl;引物P_((2))1μl;DNA样本5μl;Taq酶1.5μl;反应条件为:预变性94℃,5min;变性94℃,30s;退火60℃,35s;延伸72℃,40s,共30个循环;72℃,10min,4℃保存。扩增结束后取5μl产物在1.5%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对30只小鼠13.5d胎儿所制备的第3代MEFs进行了性别鉴定,结果表明其中13个MEFs为雄性,电泳结果同时显示大小为250bp的判断条带及399bp大小的内标条带,7个MEFs为雌性,其DNA样本体外扩增电泳结果仅显示ZFX基因内标条带,另有10个细胞系由于条带缺失无法进行性别判断,其检出率为66.67%。 本试验自主设计了雄性小鼠特异性SRY基因引物对及雌雄小鼠共有的ZXF基因引物对,并以已知性别小鼠肝脏基因组作为模板进行体外扩增,对引物合理性及有效性进行了检测,成功地建立了双重PCR性别鉴定体系;根据此体系对小鼠附植前胚胎及MEFs进行了双重PCR性别鉴定,其检出率分别达到80.00%及66.67%。通过对试验结果的分析讨论得出,从8-细胞胚胎中吸取4个卵裂球为体外扩增的适宜模板量,从13.5d胎龄制备的MEFs经过3次传代后贴壁发育情况较优,适宜用于提取基因组进行性别鉴定,此结论对小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植的研究提供了参考,具有一定实际意义。


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