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基于乙醇调控的Cre/lox重组系统在烟草中的功能验证

韩学智  
【摘要】:为实现目的基因在转基因植物体内的适时表达,可通过在所要表达目的基因上游建立一个“基因开关”,构建出可准确调控的基因表达系统而实现对基因表达的人工调控。Cre/lox重组系统由38.5 kD的Cre重组酶和34bp的lox特异性识别位点所构成,该系统中的Cre重组酶能特异性识别并介导两个lox识别位点之间的DNA序列发生删除、倒位。Cre/lox系统重组功能在细菌、真菌、动物以及植物等生物中表现高效稳定,被广泛应用于植物转基因及基因功能鉴定等领域的研究。另外,化学诱导基因表达系统的出现为人工调控基因的表达提供了可能。包括四环素诱导表达系统、类固醇激活系统、铜制剂诱导系统、乙醇诱导系统等均在植物中得到成功应用。其中的乙醇诱导基因表达系统从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中发现的,该系统中的转录因子alcR只有在与乙醇分子结合时才具有活性,可特异性作用于结构基因alcA(酒精脱氢酶.)的启动子,激活其下游目标基因表达。研究显示,该系统在诱导表达所需酒精浓度范围内对植株生长几乎没有任何生理毒害作用,具有诱导方式灵活、方便,本底极低,在实验室和大田都能有效使用的特点。本文根据上述两套系统的特性,将Cre/lox重组系统和乙醇诱导表达系统相结合,将Cre重组酶基因的表达置于乙醇调控下,通过外源施加乙醇实现目的基因的人工表达调控,建立一条植物基因调控表达的新途径。 本文以烟草为研究对象,分别构建两个植物表达载体:一是乙醇调控的Cre重组酶表达载体,该载体中,转录因子alcR在35S启动子的控制下组成性表达,Cre重组酶基因在alcA启动子的控制下表达。另外,构建了一个GUS/Bar报告基因删除激活表达载体,用于分析乙醇调控Cre重组酶的表达特点。该载体中35S启动子下游是位于两个同向lox位点之间的报告基因GUS,GUS报告基因下游是缺少启动子的Bar除草剂抗性基因。将上述两个载体用农杆菌介导的共转化法转入烟草获得转基因植株。转基因植株中的Cre重组酶一旦启动表达,将导致使其中的Gus基因删除,下游的BAR基因启动表达而获得除草剂Basta的抗性。主要研究结果如下: 1、利用农杆菌介导的叶盘共转化法,通过潮霉素和卡拉霉素双抗筛选,将PCA13alcRCre和PCA23GusBar转入烟草获得大量转基因植株。 2、随机取37株在双抗培养基(Kan和Hyg)正常生根的植株叶片进行除草剂Basta的抗性鉴定。结果发现,在除草剂(PPT)浓度为10mg/L的分化培养基上,在37株植株中,编号为1、5、6、10、11、12、25、26、32、35和36号植株真叶叶盘在含除草剂(PPT)浓度为10mg/L的分化培养基上不能分化愈伤组织及芽且叶盘逐渐变白,说明对应植株不具有除草剂Basta抗性,该类植株所占比例约为1/3。而其余共转化植株真叶叶盘在含除草剂(PPT)浓度为10mg/L分化培养基上能分化愈伤组织及芽,具有抗除草剂Basta的能力,该类植株所占比例约为2/3。Gus基因表达分析结果显示,在除草剂Basta抗性分析中所有非抗性植株叶片(1、5、6、10、11、12、25、26、32、35和36号植株)均被染成蓝色,具有抗性的植株叶片除了3、4和23号植株外,均未染上蓝色。而进一步的PCR检测结果表明不抗除草剂Basta且植株叶片染上蓝色的植株均扩增出预期大小为1.8kb的Gus基因目标条带,而抗除草剂以及叶片未染上蓝色的植株均未扩增出目标条带。 3、对10、11、12以及32号Gus基因未被自动删除植株进行外源乙醇诱导分析发现,在乙醇诱导前,叶片能被染成蓝色,表明Gus基因仍存在于植株中。用60ml 4.0%浓度乙醇灌根处理48h后,对应植株叶片在含除草剂(PPT)浓度为10mg/L培养基上保持绿色,对除草剂具有抗性。进一步对诱导后植株的叶片进行Gus的表达分析,结果显示,四株植株叶片均未被染成蓝色,显示Gus基因已经被删除。 4、自动诱导表达转基因植株alcR与Cre基因在未添加乙醇诱导情况下的RT-PCR结果显示,自动诱导启动转基因植株的alcR转录因子均正常表达的同时伴随Cre基因的表达。显示该乙醇诱导Cre重组系统在某些转基因植株中确实存在背景表达现象。 5、自动诱导表达和人工诱导表达转基因植株的半定量PCR以及定量PCR结果显示,外源乙醇处理后,自动诱导表达转基因植株的Cre表达量随诱导时间的增加,表现出先增长后降低的趋势,处理后24h时达到最高峰;人工诱导表达转基因植株的Cre表达量随诱导时间的增加,表现出降低—增长—降低的趋势,48h时达到最高峰,而24h表达量却最低。但Cre基因在自动诱导表达转基因植株各个时段的表达量明显高于人工诱导表达转基因植株的。 6、对共转化植株中GUS/Bar报告基因删除区域残留的DNA印迹进行了PCR鉴定以及序列的克隆测序分析。结果显示,乙醇诱导激活Cre基因表达对Gus基因的删除是精确而高度保守的。


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