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桔小实蝇GSTs生化及分子毒理学特性研究

胡飞  
【摘要】:桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)隶属双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,果实蝇属Bactrocera Macquar,是一种重要的危险性果蔬害虫。鉴于桔小实蝇在生产上的经济重要性,近年来有关桔小实蝇种群遗传结构、引诱剂研发、化学防治等方面的研究日益增多。然而,长期持续、不合理的使用化学杀虫剂导致其产生了严重的抗药性。目前,桔小实蝇抗性机理方面的研究主要集中于靶标酶-乙酰胆碱酯酶的生化及分子生物学特性,而对于解毒酶系与桔小实蝇抗性发展的关系知之甚少。谷胱甘肽S-转移酶(gluthione S-transferase, GSTs, EC2.5.1.18)是一类多功能超基因家族酶。GSTs作为重要的解毒代谢酶,主要功能是催化一些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合,增加其疏水性使其易于排出体外,从而达到解毒的目的。目前已知昆虫特有的GSTs Delta和Epsilon家族成员参与了昆虫对有机磷类、有机氯类和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的形成。 本学位论文以桔小实蝇为研究对象,瞄准昆虫适应逆境胁迫的机理这一研究热点,系统开展了桔小实蝇GSTs生化毒理学特性、GSTs基因的全长序列克隆、转录表达模式及异源表达研究。研究结果将有助于阐明桔小实蝇对杀虫剂抗性产生和发展的分子毒理学机理,从而在实践中建立基于GSTs的自然种群抗性的分子诊断技术。旨在为桔小实蝇的可持续治理提供理论依据,同时丰富和发展昆虫抗性机理研究的科学理论和技术体系。通过近三年的研究,取得的主要研究结果如下: 1桔小实蝇GSTs的纯化及生化毒理学特性 1.1桔小实蝇不同种群GSTs的纯化及生化毒理学特性 采用Glutathione Sepharose4B亲和层析法对桔小实蝇4个地理种群(东莞、广州、海南和云南)的GSTs进行了分离纯化和生化毒理学特性解析。结果表明,桔小实蝇4个种群GSTs纯化后的比活力相似,但广州种群的GSTs纯化回收率最低(31.54%)。聚丙酰胺凝胶电泳显示4个种群GSTs均只有一条大小为23kDa的条带。以CDNB为底物时,东莞和海南种群GSTs的Km值显著地高于广州和云南种群;海南种群GSTs的Vmax值在4个种群间最高。4个种群的GSTs最适反应温度均是37℃,最适pH值为7.5。离体抑制作用测定结果表明,利尿酸、四溴磺酚钠、马来酸二乙酯、双硫仑、姜黄素和高效氯氰菊酯均对桔小实蝇GSTs有很高的抑制率,而马拉硫磷和阿维菌素对桔小实蝇4个种群GSTs的抑制率均未到达50%。结果暗示GSTs可能介导桔小实蝇对高效氯氰菊酯的代谢抗性。 1.2桔小实蝇不同发育阶段GSTs的纯化及生化毒理学特性 采用Glutathione Sepharose4B亲和层析法对桔小实蝇不同发育阶段(三龄幼虫、蛹、成虫)GSTs进行了分离纯化和生化毒理学特性解析。结果表明,洗脱得到的桔小实蝇GSTs活性主要集中在洗脱收集到的3-5管。桔小实蝇成虫GSTs的总活性和比活力分别是370.76nmo1.min-1和16.91nmo1.min-1.μg-1,且显著高于三龄幼虫和蛹期。SDS-PAGE结果显示,桔小实蝇3个发育阶段的GSTs纯化后均获得单一条带,且分子量大小均为23kDa。无论以CDNB或GSH为底物时,桔小实蝇幼虫期GSTs的Km值均显著低于蛹和成虫期,而3个发育阶段间GSTs的Vmax无显著性差异。桔小实蝇3个发育阶段的GSTs最适反应温度均是37℃,最适pH值为7.5。利尿酸(1.15μM)和马来酸二乙酯(0.60μM)对桔小实蝇成虫期GSTs的I50。显著地低于其余两个发育阶段;四溴磺酚钠对桔小实蝇不同发育阶段GSTs的I50无显著差异;双硫仑对蛹和成虫期GSTs的I50均显著地高于三龄幼虫,而蛹和成虫间无显著差异;姜黄素对桔小实蝇成虫GSTs的I50(101.78μM)显著地高于三龄幼虫和蛹期;高效氯氰菊酯对蛹和成虫期GSTs的I50(0.90和0.78mM)显著地高于幼虫阶段;但马拉硫磷和阿维菌素对桔小实蝇3个发育阶段的GSTs的抑制率均未到达50%。结果暗示桔小实蝇幼虫期对杀虫剂高效氯氰菊酯相对更为敏感。 2桔小实蝇GSTs基因的克隆与序列分析 基于桔小实蝇转录组数据,利用RACE技术,从桔小实蝇体内分离克隆了18个GSTs基因的cDNA全长序列。通过序列分析,确定了这18个GSTs基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protparam等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质。依据其在细胞中的定位,将这18个GSTs基因分为胞质型和微粒体型两大类,分别包含17个和1个基因。根据黑腹果蝇、冈比亚按蚊、埃及伊蚊GSTs基因构建系统发育树,将其中的4个基因归类于Delta家族,8个基因归类于Epsilon家族,2个基因归类于Omega家族,另分别有1个基因归类于Theta和Zeta家族,而余下的1个基因则不能划分在已知的类型中,暂将其归为未分类家族Unclassified。这些胞质GSTs基因根据命名法则命名并在GenBank上登录,其名称和登录号分别为:BdGSTdl (JQ690090)、BdGSTd2(JN003593)、BdGSTd5(JN792452)、BdGSTd6(JN792453)、BdGSTe1(JN003588)、 BdGSTe2(JN003589)、BdGSTe3(JQ690091)、BdGSTe4(JN003590)、BdGSTe5(JN003591)、BdGSTe6(JQ690092)、BdGSTe7(JN003592)、BdGSTe9(JQ690093)、 BdGSTol (JQ690094)、BdGSTo2(JQ690095)、BdGSTt1(JQ690096)、BdGSTz2(JQ690097)和BdGSTu1(JN003587)。其中,Delta家族基因间的氨基酸同源性介于47.6-57.9%,Epsilon家族基因间的氨基酸的同源性范围为31.8-54.9%,Omega家族基因的氨基酸同源性高达85.4%,而在任意的非同一家族之间,氨基酸序列同源性仅在12.4-30%之间,但BdGSTu1与BdGSTe9的氨基酸特异性为35.9%。此外对这些GSTs基因进行分子特性分析,明确了酶促结合位点和维持酶活性构象的关键氨基酸残基。通过克隆并验证获得桔小实蝇微粒体GSTs基因1个,命名为BdGSTml, GenBank登录号JQ690098。BdGSTm1基因与黑腹果蝇DmGSTm-NP524696的氨基酸序列一致性高达91%。桔小实蝇和其它双翅目昆虫微粒体GSTs的多重比对分析发现,桔小实蝇微粒体GSTs基因中含有昆虫微粒体GSTs中特有的结构域D-P-X-V-E-R-V-R-R-A-H-X-N-D-X-E-N-I-L-P,且昆虫微粒体GSTs的氨基酸序列较短,通常在150个氨基酸左右。 3桔小实蝇GSTs基因的表达模式解析 3.1桔小实蝇GSTs基因在不同发育阶段的表达模式 在成功建立了桔小实蝇18个GSTs基因的qPCR反应体系的基础上,以桔小实蝇a-Tubulin基因作为内参基因,对这18个GSTs基因在不同发育阶段(卵、龄、二龄、三龄幼虫、蛹和成虫)mRNA表达水平进行了相对定量分析。结果发现,桔小实蝇卵期仅BdGSTel基因过量表达,暗示该基因可能与保幼激素和蜕皮激素的调控存在关联;桔小实蝇6个GSTs基因(BdGSTd2、BdGSTd5、BdGSTe5、 BdGSTe9、BdGSTt1和BdGSTz2)在幼虫期的相对表达量高于成虫期,暗示参与了幼虫期的代谢活动;桔小实蝇BdGSTe2、BdGSTe3、BdGSTe4和BdGSTe6基因随着桔小实蝇的生长发育,表达量增加上调,这表明在桔小实蝇个体发育过程中解毒代谢能力也随之增强。 3.2桔小实蝇GSTs基因在不同组织部位的表达模式 以a-Tubulin基因为内参基因,对18个GSTs基因在桔小实蝇中肠、脂肪体和马氏管3个组织中的mRNA表达水平进行了相对定量分析。结果表明,桔小实蝇BdGSTd5、BdGSTe3和BdGSTe9基因在中肠中的表达量最高,而且这3个GSTs基因都归属于昆虫特有的家族,暗示这些基因可能在外源化合物解毒代谢过程中起着重要的功能作用。其它GSTs基因在中肠不表达,可能在其他组织中起着类似的功能作用。桔小实蝇BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe6和BdGSTz2基因在脂肪体中相对表达量最高,表明这些基因可能参与解毒代谢外源化合物或保护机体免受氧化应激。桔小实蝇BdGSTd1、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe5、BdGSTe7和BdGSTul基因在马氏管中有较高的表达量。GSTs基因在桔小实蝇马氏管中的具体作用还不清楚,推测可能和参与增强马氏管的排泄作用有关。 3.3桔小实蝇GSTs基因在3种杀虫剂诱导后的表达模式 利用有机磷类杀虫剂马拉硫磷、生物源杀虫剂阿维菌素及拟除虫菊酯类杀虫剂高效氯氰菊酯对桔小实蝇进行不同时间和剂量诱导,进而应用qPCR技术解析桔小实蝇18个GSTs基因在药剂诱导后的表达模式。结果表明,马拉硫磷对桔小实蝇诱导的时间效应中,5个GSTs基因(BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6和BdGSTm1)诱导12h后相对表达量最高,2个GSTs基因(BdGSTd2和BdGSTo1)诱导24h后相对表达量达最高峰,而另外8个GSTs基因(BdGSTd1、BdGSTe1、 BdGSTe2、BdGSTe3、BdGSTo2、BdGSTtl、BdGSTz2和BdGSTul)相对表达量的最高峰延迟到诱导后48h,说明这些GSTs基因可能均参与马拉硫磷在桔小实蝇体内的代谢过程。马拉硫磷亚致死剂量(LD10)处理桔小实蝇24h后,10个GSTs基因(BdGSTd1、BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe2、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6、 BdGSTo2、BdGSTt1和BdGSTul)相对表达量最高,表明这些基因可能介导桔小实蝇对马拉硫磷的代谢抗性。 阿维菌素对桔小实蝇诱导的时间效应中,2个GSTs基因(BdGSTe6和BdGSTm1)诱导12h后相对表达量最高,6个GSTs基因(BdGSTd1、BdGSTd2、 BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe4和BdGSTe9)诱导24h后相对表达量达最高峰,阿维菌素致死中剂量(LD50)诱导桔小实蝇24h后,7个GSTs基因(BdGSTd1、 BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6和BdGSTml)相对表达量达到最高峰,暗示这些GSTs基因可能均参与阿维菌素在桔小实蝇体内的解毒代谢作用。 高效氯氰菊酯对桔小实蝇诱导的时间效应中,3个GSTs基因(BdGSTe2、 BdGSTe5和BdGSTe6)诱导12h后相对表达量最高,而另外6个GSTs基因(BdGSTe4、BdGSTe9、BdGSTo2、BdGSTt1、BdGSTu1和BdGSTml)相对表达量的最高峰延迟到诱导后36h,说明这些GSTs基因可能均参与高效氯氰菊酯在桔小实蝇体内的代谢过程。而高效氯氰菊酯亚致死剂量(LD10)诱导桔小实蝇后,BdGSTd1、BdGSTe4、BdGSTe7和BdGSTtl基因表达上调,暗示桔小实蝇GSTs基因可能参与高效氯氰菊酯的解毒代谢过程。 3.4桔小实蝇GSTs基因在不同品系中的表达模式 采用定量PCR技术,以a-Tubulin基因为内参基因,解析克隆获得的桔小实蝇18个GSTs基因在实验室选育并保存的桔小实蝇马拉硫磷和高效氯氰菊酯抗性品系及敏感品系中的表达模式。结果表明,在马拉硫磷抗性品系中,BdGSTd5、 BdGSTe9和BdGSTz2基因的相对表达量显著高于敏感品系,而BdGSTe1、BdGSTe2和BdGSTtl在抗性品系中的相对表达量显著低于敏感品系。暗示这些GSTs基因可能介导了桔小实蝇对马拉硫磷抗性的形成。桔小实蝇高效氯氰菊酯抗性品系中,8个GSTs基因(BdGSTd6、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe5、BdGSTe6、BdGSTe7、 BdGSTtl和BdGSTm1)在抗性品系中的相对表达量显著高于敏感品系,暗示这些基因可能参与了桔小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢作用。 4桔小实蝇BdGSTe5基因的原核表达 采用NdeI和HindⅢ双酶切位点及DNA重组技术构建了桔小实蝇BdGSTe5基因基于BdGSTe5-pET28a (+)的原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳发现含有重组质粒BdGSTe5-pET28a(+)的细菌中在27kDa下方有一条特异性的蛋白质条带。根据蛋白质分子量估算,表达的融合蛋白质分子量大约为26kDa,由于6×His-tag标签及其侧翼序列片段大约占1kDa,因此该特异性条带分子量与预期表达的融合蛋白大小相一致。采用Ni柱和DEAE柱依次对BdGSTe5-pET28a(+)重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE验证,在分子量为27kDa处获得单一条带。 综上所述,通过亲和层析法分离纯化GSTs并比较研究纯化产物的动力学和毒理学特性;应用高通量测序及RACE技术克隆桔小实蝇GSTs基因的全长序列,结合qPCR技术解析其mRNA在桔小实蝇不同发育阶段、不同组织部位和不同品系中的表达模式,鉴定了参与该虫抗性的GSTs基因。研究结果将促进对桔小实蝇GSTs基因生理功能的认识,为桔小实蝇抗性相关GSTs基因的鉴定提供理论依据,并对阐释GSTs介导桔小实蝇代谢抗性的分子生物学机制具有重要的理论意义。


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