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家蚕暗化型(mln)与石蚕(st)突变体的定位克隆及其候选基因的功能研究

乔梁  
【摘要】:家蚕不仅是重要的农业经济昆虫;其适中的身型,较短的生长周期,较高的繁殖率等先天优势与完备的基因组数据,分子标记连锁图谱,遗传变异图谱以及百余年经典遗传学研究所积累的大量突变资源使之成为鳞翅目的模式生物。家蚕突变基因资源的类型众多,涉及体色,躯体附肢发育,体型体态,变态发育,氨基酸代谢,尿酸盐代谢,卵色卵型,致死等;同时,已记载的孟德尔突变超过450个,其中约300余个突变被定位于家蚕各连锁群。如此丰富的突变资源在养蚕缫丝业,家蚕基础生物学研究的模式动物化,家蚕生物反应器,甚至是生物学基础研究等领域扮演着重要的角色。 家蚕突变体中所占比例非常大的两个类群是体色和体型突变。在鳞翅目昆虫中,体色和体型模式对其生存和繁衍具有重要的意义。研究家蚕体色和体型突变体的形成机制不仅有助于理解鳞翅目昆虫色素及形态发育的代谢和调控网络,还能够为家蚕功能基因的利用(如家蚕实用种的育种应用或鳞翅目害虫防治)提供思路。因此,我们选择家蚕代表性黑化突变暗化型及幼虫体型代表性突变石蚕作为研究对象,利用定位克隆技术分离这两个突变体的候选基因,并对候选基因进行相关的功能研究。所取得的主要研究结果如下: 1.暗化型和石蚕突变体的分子定位及候选基因筛查 我们利用SSR分子标记对mln和st位点进行了初步定位,分别获得了包含mln和st位点的分子标记连锁图谱。其中,标记S1807与mln位点紧密连锁;与st位点最近的标记S0809虽然与其图距为49.6cM,但是整张图谱中其他标记之间的相对位置及距离与他们在基因组上的位置和间距吻合,适于进行对st位点的进一步分析。根据分子连锁图中突变基因所在位点与其最近分子标记间的距离和家蚕分子连锁图谱与物理图谱中图距的对应关系进行换算,推测突变基因大概所在的基因组物理位置,并结合生物信息学分析筛查候选区域内可能的候选基因。对于mln来说,在候选区域内,我们关注一个预测基因BGIBMGA008538.该基因在果蝇中的同源体AANAT1能够催化多巴胺等单胺类物质,而多巴胺为黑色素的前体物质,同时该基因的组织芯片数据显示其在幼虫头部高表达,而头部是mln表型最明显的部位;时期芯片数据显示该基因在蛹后期及蛾期高量表达,而mln突变在蛹后期至蛾期明显黑化,若mln中BGIBMGA008538基因功能缺失,存在的无法消耗多巴胺的可能性时,便有可能导致多巴胺过量累积,而形成黑化;另外,基于该预测基因的基因组片段所设计的多态性标记P3C在定位群体中的分型结果显示其与mln位点间没有发生重组;进一步的,对P3C的测序结果显示,在mln中,预测基因BGIBMGA008538的第三外显子存在序列缺失,所以我们将BGIBMGA008538确定为mln突变的候选基因。对于st突变来说,我们通过遗传图距与物理图距的换算,推算最近标记S0809与st位点相距约为14.88Mb,并结合分子图谱中标记间的排序,标记所在位置,家蚕第8号染色体物理图谱中scaffold和gap的长度,我们推测st位点可能落在nscaf2827。进一步关联st的表型,我们推测st突变可能与表皮蛋白相关。我们对nscaf2827上三个预测的表皮蛋白基因进行芯片分析,基因分型分析及RT-PCR分析,结果显示,预测基因G2在幼虫期较为特异的表达;该基因与st位点间没有发生重组且基于其cDNA序列的扩增产物在野生型与st突变中差异明显。因此,我们将G2基因确定为st突变的候选基因。 2.暗化型和石蚕突变体候选基因的克隆及其在野生型与突变中的序列差异分析 我们克隆了mln与st突变候选基因的全长cDNA及差异所在的基因组序列,并且分析比较它们在野生型与突变中的差异。结果显示:野生型大造的cDNA扩增出一条1460bp的片段,而mln突变中扩增出两条片段,分别为1407bp和1253bp。我们将此3条转录本的测序结果结合前章大造与大造mln中P3C扩增片段的测序结果联合分析,结果表明:突变型缺失了96bp的外显子(67bp)内含子混合序列,同时又插入了29bp的内含子序列。大造中的Bm-iAANAT有5个外显子并编码261个氨基酸残基,具有完整的乙酰基转移酶结构域。大造-mln中的第一种异常的转录本type-1的cDNA缺少除前2bp以外的整个第4外显子,并移码形成了提前终止密码TAG。第二种异常转录本Type-2缺少第4外显子的后67bp,另外插入了15bp的内含子序列。Type-2的终止密码子位于正常转录产物的3’UTR处。所以,type-1与type-2都编码了潜在的异常蛋白质,与野生型相比,均破坏了乙酰转移结构域。st突变的候选基因Bm-st全长547bp,包含4个外显子,其中5'UTR为38bp,3'UTR为77bp。编码143个氨基酸,具有典型的几丁质结合结构域。而在st突变中存在58bp的缺失及6处单碱基替换,并有移码产生。突变后的Bm-st的几丁质结构域被完全破坏,功能上存在潜在缺失性。 3.mln候选基因的表达模式及其在野生型与突变中的表达差异分析 mln突变的候选基因Bm-iAANAT基因的时期表达分析从4龄第3天幼虫开始到羽化结束。RT-PCR分析显示Bm-iAANAT的表达水平在该发育时期具有波动性。在4龄第3天(蜕皮间期)时表达正常,在第4次蜕皮阶段开始时(0-16小时)停止表达,蜕皮阶段后(24小时后)表达重新开始。在5龄起蚕阶段的大部分时间表达量相对较高,在刚上蔟时没有检测到表达。在上蔟末期(W2.5天),与20E的滴度呈负相关,Bm-iAANAT的表达量显著上升(32)。最高表达量出现在化蛹后的第7天(P7)与第8天(P8)。组织表达模式的结果显示,Bm-iAANAT基因在幼虫头部,丝腺和体壁中表达丰度高。尤以头部的表达量为最高。Bm-iAANAT基因的表达量在其它组织中十分低或几乎检测不到。Bm-iAANAT基因在家蚕不同骨化程度部位的表达模式显示:Bm-iAANAT基因在高度骨化的组织(头,胸足和肛板)中的表达量比在低度骨化组织(表皮)中高。也就是说,Bm-iAANAT的高表达量与mln突变型蚕体中的黑色部位有关,而与非黑色部位无关。5龄第4天,化蛹第2天和羽化时期大造-mln与大造中Bm-iAANAT的半定量结果显示:mln中的两种转录产物的表达量比大造中正常转录产物的表达量要低;定量PCR结果表明,在野生型家蚕体中正常Bm-iAANAT的表达量为mln突变体中两种转录产物表达量之和的10-20倍。另外,在能够表现出mln与大造表型差异的部位(头,胸足和肛板)中,Bm-iAANAT的表达量仍然是大造高于mln突变体。4.st候选基因的表达模式,在野生型与突变中的表达差异以及蜕皮激素对该候选基因表达量的影响 st突变的候选基因Bm-st基因在4龄及5龄幼虫食桑期均维持较高的表达量;在4龄刚眠时几乎不表达;且该基因自蛹2天后表达量明显下调。主要表现为幼虫及蛹前期表达。组织表达模式显示Bmm-st在幼虫的头部,体壁,脂肪体,气管高表达,其他组织表达量非常弱或几乎检测不到。Bm-st基因的时空表达模式与st突变只在幼虫期出现表型,且出现表型的部位为表皮相吻合。利用20E处理家蚕后,我们发现,处理3小时后,处理组Bm-st基因的表达量已经低于对照组(半定量及定量结果),处理24小时后,处理组已经发育为老熟幼虫,Bm-st基因的表达量明显低于对照组(半定量及定量结果),这表明蜕皮激素对Bm-st基因的表达具有抑制作用。 5.黑色素代谢关键基因在mln与野生型中的差异分析及Bm-iAANAT基因的功能研究 我们详细比较了黑色素代谢途径中的关键基因在已着色的野生型与mln突变头部,胸足,肛板中的差异,结果显示,在这些部位中Pale,Ddc和Yellow3个基因的表达量在大造中高于在大造-mln中。但是,除头部以外,ebony基因的表达量在大造中低于在大造-mln中。根据Ddc基因的在突变中的表达模式,我们推测mln中因Bm-iAANAT基因功能缺失而累积的大量多巴胺压抑Ddc基因的表达,并通过野生型与突变中多巴胺的定量分析证实了推测。Bm-iAANAT基因的RNAi结果显示,干涉组中约有20%的个体体色明显黑化,且其Bm-iAANAT基因的表达量明显低于对照组,表明Bm-iAANATT基因的确参与多巴胺的消耗及家蚕的着色。本论文的研究第一次报道了AANAT类基因在昆虫体色模式的形成中扮演着重要角色。 6.儿茶酚胺类物质与黑色素基因的相互作用对mln突变鞣化部位着色方式及物理性质的影响 我们详细比较了不同发育阶段野生型与mln突变体中黑色素代谢基因的表达及儿茶酚胺类物质的含量,并比较了它们在野生型与突变体中的差异。结果表明,突变多巴胺、NBAD与(?))dc,ebony,black及tan基因的相互调控与AANAT基因的缺失,使得mln突变在不同发育阶段按照既定的模式着色。我们在mln突变中注射β-丙氨酸后,改变mln中固有的色素代谢模式,成功反转了mln的黑化表型,并进行了相关色素物质前提及基因的检测。扫描电镜对野生型与mln突变体成虫背板截面的观察结果显示,mln的背板明显出现分层状结构,这与mln中缺乏交联物质NADA有密切关系。野生型与突变体成虫翅膀的机械性能显示,mln翅的弹性模量明显高于野生型,而阻尼性则明显低于野生型,由于是利用近等位基因系及进行分析,因此野生型与突变体翅膀机械性能的不同主要是由于两者间不同的儿茶酚胺代谢所造成的。 7.野生型与st突变表皮中几丁质的测定、Bm-st基因的RNAi及原核表达研究 st突变与野生型幼虫盛食期表皮几丁质(N-乙酰葡萄糖胺)含量的测定结果显示:st突变中葡萄糖胺的含量为385.95±55.04119μg/mg,野生型中的含量为525.28±38.25767μg/mg。st突变中葡萄糖胺的含量的确是低于野生型。这可能与Bm-st基因的功能缺失或不足有关。我们根据Bm-st的表达模式选定幼虫4龄减食期为注射时期,注射后5龄刚蜕皮的时候观察表型。结果显示,干涉组约有41.1%的个体无法完成蜕皮,且这些个体体壁明显紧绷,手触有坚硬感,与st突变的表型较类似;极端个体表皮异常,影响体形甚至全身渗血黑化。分子检测的结果显示,干涉组有表型的个体Bm-st基因的表达量显著低于对照组。为了研究野生型与突变中正常与异常的Bm-st蛋白与几丁质的结合情况,我们分别构建了含有野生型与突变型Bm-st基因CDS序列的原核表达载体pET32a-WT与pET32a-st。通过诱导表达获得了野生型与突变体的重组型蛋白,为后续的结合实验及野生型与突变中Bm-st天然蛋白表达的检测奠定了基础。


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