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矮牵牛PMADS20基因的克隆及其功能的初探

杨子  
【摘要】:矮牵牛PMADS20基因是MADS—box基因STMADS11亚家族成员之一。MADS—box基因是广泛存在于动物、植物和真菌中的一类转录因子,在转录水平上调控一系列基因是否转录,何时转录,并决定转录的频率。生命有机体的不同器官、组织及其发育生长的各个时期都存在转录因子基因的表达。STMADS11亚家族基因的主要功能是控制营养器官各个时期的发育以及在空间和时间上决定营养生长到生殖生长的转变。通过分析PMADS20基因及STMADS11亚家族其它成员的序列,表明PMADS20基因可能矮牵牛芽的形成有关,从而促进矮牵牛向生殖生长的转变。 转录因子(transeription factor,TF)又称之为反式作用因子,与顺式作用元件的启动子特定DNA序列相互识别、结合,从而直接或间接调控基因转录的精确起始和转录效率。转录因子根据其转录调控能力可分为转录激活子和转录抑制子。根据转录抑制蛋白的不同,及作用方式的不同,分为主动抑制转录因子和被动抑制转录因子。其次,根据与DNA结合途径的不同,可再次分为MYB类、bHLH类、bZIP类、锌指类和AP2/EREBP类。植物主动抑制子还可以根据其抑制结构域继续分类。关于植物转录抑制因子的研究还不够完善,目前,以EAR结构为例。EAR结构域是一种抑制结构域,仅含有12个氨基酸序列,在转基因拟南芥植物中具有主动抑制子的作用,不仅抑制特定目的基因的表达,同时也在一些转录因子中出现,并产生一些显性功能缺失的表型。抑制结构域是转录抑制因子和相关基因表达调控机制的中心,不同的转录因子与不同的EAR结构聚合在一起,可以抑制目的基因的表达。因此,融合抑制转录因子沉默技术(CRES-T)成为新的基因沉默技术之一。 首先,本实验使用PCR法,从矮牵牛叶片cDNA中克隆得到了PMADS20基因的编码区(GenBank:GU129907)。其次,通过基因比较分析发现,PMADS20基因与拟南芥SVP基因和AGL24基因有较高的同源性,属于MADS-box基因STMADS11亚家族。第三,使用荧光定量分析表明PMADS20基因在根、茎、叶中表达,特别是腋芽中优先表达。最后,通过构建PMADS20基因植物超量表达载体PG-503和通过融合抑制基因沉默技术(chimeric repressor gene-silencing technology, CRES-T)构建PMADS20基因融合沉默载体PG-504;利用农杆菌转化法将PMADS20基因介导进入矮牵牛叶片,在筛选培养基上诱导形成愈伤组织,进而筛选出含有目的基因及抗除草剂标记基因的幼苗,最后获得阳性转基因植株。现已得到并鉴定PG503与PG504转基因各35个株系。PG503转基因植物与野生型对照植株相比,无明显表型;但PG504转基因植物与野生型对照植株相比,表型明显,植株株高下降,分支稠密,节间缩短,叶片狭长,开花时间推迟,推测PMADS20基因可能对植物由营养生长向生殖生长起促进作用。同时推测其下游可能存在功能冗余基因,共同调控植物相关生命活动。目前,对PMADS20基因功能分析和验证取得了一定的成功,对于进一步了解PMADS20基因表达调控的特点有着重要的意义。


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