收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Nosema属微孢子虫基因组特异共线性区域的进化与功能分析

罗洁  
【摘要】:DNA作为遗传物质在承载着生命延续的同时也为分子考古学家研究人类的起源、物种的进化史提供了新的契机。近年来,随着基因组数据库的丰富和完善,生物学家逐渐发现接近1/3的物种都具有物种特异基因,鉴于它们大多是随机产生和自然选择双重压力下被保留下来的“化石”基因,对物种的环境适应性、自然习性起着很关键的作用,有的甚至在人脑和视觉蛋白形成过程中扮演举足轻重的作用,因此逐渐受到遗传学家和分子考古学家的青睐。 微孢子虫做为一种存在广泛宿主的“无线粒体”原生动物,它们兼具原核细胞和真核细胞的特征,尽管对于它们的进化地位仍然存在争议,但是近年来,越来越多的研究表明它们是进化地位较低的真核生物,并且目前已被NCBI归类为真菌类。其中家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)作为首个被鉴定的微孢子虫,专性寄生于经济昆虫家蚕,是引发家蚕微粒子病的病原体。家蚕微孢子虫能够在外界环境刺激下,成功弹出极丝,将孢原质送入宿主体内从而成功的寄生,进而引起家蚕生理机能障碍,造成宿主细胞的病变坏死以及组织器官功能的丧失。鉴于其对人类经济生活带来的巨大危害,目前,家蚕微孢子虫已被世界各养蚕国家和地区列为唯一法定检疫对象。尽管对其研究已有近150年的历史,但是微粒子病的防控仍然是蚕业界研究的重点和难点。随着基因组时代的来临,人们获得了越来越多的微孢子虫基因组序列信息,因此,基于比较基因组学分析,探索不同种属之间的微孢子虫的差异基因的种类、数量及功能,对于研究不同种类微孢子虫生物学特征,发掘微孢子虫与其对应宿主之间的共进化关系,以及为寻找种属特异的检测靶标基因,具有十分重要的生物学意义。近年来,本实验室对家蚕微孢子虫进行了全基因组框架图的绘制,基于全基因组序列的数据,并结合已报道的其他微孢子虫基因组,我们首次鉴定到一段Nosema属特有的基因组区域,为哺乳动物寄生性微孢子虫——兔脑炎微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫基因组所缺失。这段Nosema属微孢子虫基因组共线性区域的演化历程是怎样的?分布于该基因组特异区域内的编码基因在家蚕微孢子虫基因组中扮演什么样的角色?鉴于物种特异基因在研究微孢子虫进化史以及不同微孢子虫间的分子鉴定两方面的重要性,同时也为了回答上述问题,本论文的主要研究内容包括: 1. Nosema属微孢子虫特异基因组共线性区域的鉴定与分析 对家蚕微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和蜜蜂微孢子虫的同源基因进行比较分析,发现家蚕微孢子虫第32号Scaffold上存在一段1Nosema属特异的基因组区域,进而在已发布基因座位信息的六种微孢子虫中进行基因座位保守性分析,进一步证实该区域为脑炎属微孢子虫及比氏肠道微孢子虫基因所丢失的基因组片段。通过对其中分布的编码基因的预测及分析,发现这段特异的基因组区域存在两个编码序列,基因代号为NBO32g0034和NBO32g0035,前者编码DNA聚合酶kappa(简称NbPolκ),后者NBO32g0035的预测功能未知(简称NbOP1), RT-PCR实验证实这两个基因均能够正常转录。对该区域上游970bp序列进行启动子和调控元件预测,发现该区域存在保守的TATA框和GC框结构,并且含有SP1结合位点、CAP/CRP结合位点、bZIP (Basci-leucine zipper)转录因子蛋白、Tst-1结合位点和c-Myb等参与转录活性调节的调控基础序。该区域的GC含量明显大于N.bombycis基因组的平均GC含量,并且大量分布DNA类型的转座元件,暗示该区域是基因组不稳定区域。 2. NbPolκ和NbOPl蛋白的编码基因序列特征及其染色体定位研究 为了深入了解分布于该段特异基因组区域内的编码基因特征,我们首先针对NbOP1的编码基因进行预测及分析,结果显示该蛋白在家蚕微孢子虫基因组中不存在其他拷贝,其序列不具有信号肽,仅含有4个疏水簇,并且富含极性氨基酸,随后对该位置蛋白的二级结构进行预测,发现其包含20个a螺旋和11个β折叠。经过克隆测序发现该基因具有核苷酸多态性,属于典型的孤儿蛋白。 随后,我们对NbPolκ蛋白的编码基因进行了生物信息分析,确定其D87至L417存在保守的DNA聚合酶kappa功能结构域,但比典型的真核生物POLK存在N-端和C-端的减缩,但是,这种两端不同程度的缺失并没有影响其氨基酸的结构特征。而用最大似然法构建的系统发育树结果显示NbPlκ与其他三种微孢子虫的POLK聚为一簇,但是这一簇基因却与真菌界的亲缘关系较远,而是落入了细菌域,并与梭状芽孢杆菌(Clostridia)亲缘关系较近。该系统发育树在一定程度上反映了NbPolκ的进化历程,推测NbPoκ可能水平转移自某一种细菌。 通过对NbPolκ和NbOP1的同源信息检索,并制备探针进行Southern blot杂交,结果说明我们所分析的具有Nosema属微孢子虫基因组共线性区域位于家蚕微孢子虫的第XV染色体上。 3. NbPolκ和NbOP1的在酿酒酵母中的定位 首先采用亚细胞定位导肽预测软件对这两个基因进行亚细胞定位预测,结果显示NbPolκ可能分布于细胞核或者线粒体中,而NbOP1则具有细胞质定位特征。随后利用酿酒酵母表达系统,检测其各自的亚细胞定位分布。结果表明,NbOP1定位于酿酒酵母的细胞质;而NbPolK则能够靶向酿酒酵母线粒体,并且N-端导肽序列对于NbPolκ的定位信号没有任何影响。这一结果与克鲁斯锥虫的同源基因TcPolκ能够具有线粒体定位信号的特征相符合,暗示寄生生活中的NbPolK的特殊地演化地位及其与典型真核生物Po1κ的功能分化。 4. NbPolκ和NbOPl在家蚕微孢子虫基因组中的功能验证 为了更好的了解这两个编码基因在家蚕微孢子虫基因组的表达定位特征以及其可能存在的功能。我们构建了原核表达载体,通过重组融合蛋白的诱导表达和纯化,获得了与理论分子量一致的重组蛋白,用其免疫小鼠以制备多克隆抗体。免疫印迹结果显示所得抗血清特异性较好,能够识别与理论分子量相近的蛋白条带。分别用其与成熟孢子和处于增殖期的孢子进行间接免疫荧光,表明NbOP1为一种新鉴定到的位于家蚕微孢子虫孢壁的蛋白;而NbPolκ则是定位于家蚕微孢子虫细胞核的参与氧化损伤途径的蛋白。 5. Nosema属微孢子虫基因组特异共线性区域的进化历程假说 根据我们前面对两个编码基因的研究,结合微孢子虫的物种进化分析,我们通过总结实验结果并提出了该片段在微孢子虫基因组中进化历程的假说。假说核心为,微孢子虫的最近共同祖先(Last Common Ancester, LCA)通过水平基因转移或垂直遗传获得Nosema属微孢子虫基因组特异共线性区域,之后,该区域在微粒子属与脑炎属微孢子虫在物种分化之后各自独立进化。,NbPolκ勺保留可能是为了应对家蚕微孢子虫和蜜蜂微孢子虫来自昆虫宿主的剧烈地氧化应激(酚氧化物酶通路)的攻击所造成的DNA损伤,但是可能由于功能退化或者功能分化进而NbPolκ仅保留在四种感染昆虫的微孢子虫的基因组中中然而,家蚕微孢子虫物种特异基因NbOP1的保留是由于家蚕微孢子虫宿主专性适应性需要而衍生出的新的功能基因。当然,这些推论亟待进一步的实验验证。 综上所述,本研究首次对家蚕微孢子虫物种特异基因进行细致的研究,并同其他微孢子虫的基因座位保守性进行了比较研究,证实这段Nosema属微孢子虫基因组特异共线性区域中的两个功能基因均能够编码家蚕微孢子虫生理代谢途径不可或缺的重要蛋白。最后,结合前期的分析数据我们对该区域的成因进行了初步探讨,并提出微孢子虫中差异基因序列的形成机制的假说。总之,本研究初步探索了家蚕微孢子虫专性细胞内寄生生活所形成的寄生虫与宿主协同进化历程,同时,也为筛选家蚕微粒子病的分子检测靶标基因奠定分子生物学基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 崔红娟,万永继,周泽扬,鲁成;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白提取法研究[J];西南农业大学学报;1999年04期
2 秦春圃;用新法检测家蚕微孢子虫病[J];生物技术通报;2002年06期
3 邢建民;感染了微孢子虫Nosema mesnili的斜纹夜蛾幼虫的急性麻痹症状[J];微生物学杂志;1994年01期
4 潘国庆,李艳红,谢俪,庞敏,潘敏慧,鲁成,周泽扬;家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较[J];重庆师范大学学报(自然科学版);2005年03期
5 王见杨,黄可威;微孢子虫的分子生物学研究进展及检测治疗[J];蚕业科学;2000年S1期
6 李艳红;吴正理;潘国庆;庞敏;胡军华;张瑞芝;周泽扬;;家蚕微孢子虫在家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1中的极丝弹出情况[J];动物学报;2007年06期
7 王敏;许金山;王林玲;张小燕;周泽扬;;两株不同地域的家蚕微孢子虫分离株的细胞侵染力比较及遗传多样性分析[J];遗传;2009年11期
8 孙胜,宗浩,何献君,杨小蓉;家蚕微粒子(Nosema bombycis)种群数量动态的研究[J];四川师范大学学报(自然科学版);2003年06期
9 Norma.J.Pieniazck;刘吉平;;小亚单位核糖体RNA编码区序列在微孢子虫分类上的应用[J];广东蚕业;1997年04期
10 陶美林;潘国庆;胡怀翠;周泽扬;;家蚕微孢子虫丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白serpin基因NbSPN106的鉴定[J];微生物学报;2009年06期
11 王丽英,严毓骅,管致和;蝗虫微孢子虫对东亚飞蝗的实验感染[J];昆虫学报;1990年01期
12 胡军华;潘国庆;许金山;芦琨;党晓群;吴正理;李艳红;周泽扬;;线粒体型蛋白frataxin在家蚕微孢子虫中的鉴定与分析[J];微生物学报;2008年05期
13 谢伟东;蓖麻蚕微孢子虫的超微结构研究[J];动物学报;1989年04期
14 Canning E U.;张平;;朱砂蛾Tyria jacobaeae中的两种寄生性微孢子虫:Nosema tyriae n. sp.和Nosema sp.[J];广东蚕业;2006年04期
15 刘吉平;曾玲;;Calcofluor White M2R荧光染色法识别家蚕微孢子虫[J];昆虫学报;2007年11期
16 申子刚;潘国庆;许金山;李田;刘含登;周泽扬;;重庆地区家蚕微孢子虫遗传多态性分析[J];自然科学进展;2008年05期
17 孙胜,宗浩,杨小蓉;家蚕微孢子(Nosema bombycis)对菜青虫(Pieris rapae)的感染与致病性研究[J];四川师范大学学报(自然科学版);2001年01期
18 谭小辉;潘国庆;吴正理;李艳红;张瑞芝;许金山;周泽扬;;家蚕微孢子虫孢壁蛋白与其发芽的相关性[J];动物学报;2008年06期
19 王见杨,黄可威,赵昀,陆长德;微孢子虫RNA的制备方法[J];蚕业科学;2000年03期
20 张志宇,陈毕生,李国荣;齐罗汉虫发育的超微结构观察[J];热带海洋学报;1989年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 冯真珍;曹翠平;邱海洪;吴小锋;鲁兴萌;;粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬作用研究[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
2 ;Mitochondrial Pyruvate Dehydrogenase E1 of Nosema bombycis:a Marker in Microsporidian Evolution[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
3 陈大睿;沈中元;唐旭东;徐莉;朱峰;陶恒平;管蕊;;丙硫咪唑对家蚕微孢子虫β-tubulin基因表达抑制作用的研究[A];中国蚕学会商品性小蚕饲养规程和蚕病防控学术研讨会论文集[C];2010年
4 朱峰;董世楠;徐莉;沈中元;;蓖麻蚕微孢子虫(Nosema philosamiae)核糖体基因全序列的克隆及系统进化分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(1)[C];2009年
5 李田;潘国庆;党晓群;周泽扬;;重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库的构建及EST测序分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
6 杨柳;潘国庆;刘含登;许金山;李田;刘铁;张绍鹏;周泽扬;;家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
7 潘国庆;谭小辉;党晓群;李田;郭广清;周泽扬;;家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32的表达谱分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
8 崔红娟;周泽扬;鲁成;万永继;向仲怀;;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白P29.4基因的研究简报[A];重庆市遗传学会第一届学术年会暨纪念孟德尔规律再发现100周年学术讨论会论文集[C];2000年
9 吴晓霞;冯真珍;邱海洪;蔡顺风;李明乾;鲁兴萌;;粉纹夜蛾培养细胞对家蚕微孢子虫的吞噬及与孢壁蛋白的关系[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
10 韦亚东;张国政;陆长德;;家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究[A];中国蚕学会第四届青年学术研讨会会议论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 罗洁;Nosema属微孢子虫基因组特异共线性区域的进化与功能分析[D];西南大学;2013年
2 党晓群;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2012年
3 刘含登;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组学研究[D];西南大学;2011年
4 林立鹏;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2012年
5 向恒;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组学研究[D];西南大学;2010年
6 蔡顺风;家蚕微孢子虫孢子母细胞的分离及孢子吞噬作用的研究[D];浙江大学;2012年
7 姜义仁;柞蚕微孢子虫检测及感染柞蚕中肠转录组及蛋白质组学研究[D];沈阳农业大学;2012年
8 李治;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白SWP5的研究[D];西南大学;2012年
9 张凡;家蚕微孢子虫侵染相关表面蛋白SP84的分离、纯化及鉴定[D];浙江大学;2007年
10 陶美林;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)serpin蛋白的研究[D];西南大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵丽芳;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2013年
2 马成;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2012年
3 邓远洪;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2012年
4 周小伟;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2013年
5 刘婷;家蚕微孢子虫单克隆抗体G9靶蛋白的鉴定[D];西南大学;2013年
6 马强;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究[D];西南大学;2013年
7 王敏;家蚕微孢子虫MITE转座子鉴定及分子标记的建立[D];重庆师范大学;2010年
8 王钰;感染家蚕微孢子虫后家蚕中肠cDNA消减文库的构建及差异表达基因的功能分析[D];重庆师范大学;2013年
9 郭广清;家蚕微孢子虫检测及微粒子病预报研究[D];西南大学;2010年
10 贾立丽;家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)ricin B-lectin基因nbrtb649的克隆表达及蛋白定位研究[D];西南大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 省农科院蚕业研究所副研究员 叶建美;家蚕微粒子病防治[N];湖北科技报;2000年
2 周建明;无锡局建立过程预控体系确保蚕种出口[N];中国国门时报;2005年
3 通讯员 李金盆;我市一蚕桑产业化项目被列为省科技创新工程[N];安康日报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978