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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖复制关键基因的筛选与鉴定

何倩  
【摘要】:家蚕作为具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,在世界的文化传播、经济和社会的发展中发挥了重要作用。然而每年因蚕病引起的损失占蚕业总生产的比例高达25%。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus, BmNPV)是蚕业上危害最严重且最常见的一类病原微生物。随着1999年对BmNPV全基因组序列测定的完成,BmNPV的侵染增殖分子机制的研究逐渐深入。本研究利用家蚕内源性的microRNA骨架,采用RNAi技术,筛选及鉴定BmNPV增殖复制的关键基因。主要研究结果如下: 1. BmNPV增殖复制相关基因的筛选与克隆 根据文献报道的杆状病毒基因功能分析,初步筛选与BmNPV增殖复制相关的34个基因进行克隆。其中参与病毒DNA复制的基因有9个,参与病毒BV产生的基因有28个,与核衣壳产生相关的基因有12个,影响晚期基因表达的基因有8个,影响极晚期基因表达的基因有7个。 2. BmNPV增殖复制关键基因的鉴定 从已初步筛选的34个基因中最终筛选8个候选基因作为后续实验的研究对象。这8个基因分别是:dbp、lef2、lef3、lef7、lef10、lef11、p143、vp1054。分别构建这8个基因对应的干涉载体和荧光素酶载体,转染BmN-SWU1细胞。转染细胞48h后测酶活,发现lef2和lef11的抑制效果达到90%以上,dbp、lef3、 p143、vp1054抑制效果达到80%以上,而lef10抑制效果只有12.4%,lef7没有抑制效果。在病毒的感染率统计实验中,pIZ-DsRed-milef11转染的细胞中病毒的感染率仅为9.16%,pIZ-DsRed-milef10病毒感染率为26.2%,pIZ-DsRed-midbp、pIZ-DsRed-milef3病毒感染率分别为58.4%和54.6%,pIZ-DsRed-mip143和pIZ-DsRed-mivp1054病毒感染率分别是71.1%和67.3%,而pIZ-DsRed-milef2, pIZ-DsRed-milef7感染率达到了100%。以上结果表明在本研究所筛选的8个候选基因,lefll是BmNPV增殖复制的关键基因。 3.不同启动子驱动的同一干涉载体对病毒增殖复制的影响 将筛选的7个活性不同的启动子A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70分别替换pIZ-DsRed-milef11中的IE2启动子,并将构建的干涉载体转染BmN-SWU1细胞,转染细胞48h后测酶活。A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、 hr3A4、hsp70干涉载体对lefll基因的抑制效果分别是92.6%、97.9%、96.9%、94.8%、95.3%、96.8%、97.9%。在病毒的感染率统计实验中,A4、IE1、IE1-295、 IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉载体转染的细胞中,病毒的感染率分别是18.1%、8.34%、8.41%、11.1%、11.9%、12.1%和11.8%。干涉效果以及对病毒增殖复制的影响结果分析表明IEl启动子是筛选的7个启动子中最优化的启动子,其驱动的pIZ-DsRed-milef11干涉载体也是本研究中最优化的干涉载体。


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