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家蚕BmGBP基因的鉴定及其对BmNPV复制的影响

潘彩霞  
【摘要】:家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目模式昆虫,具有重要的经济价值。以家蚕为基础的蚕丝业是我国许多地区农民增收的骨干型或支柱型产业,并且在世界的文化传播、经济和社会的发展中发挥了重要作用。然而它正面临来自致病病毒、真菌、细菌和家蚕微粒子等病原微生物的危害,导致每年10%左右的潜在的蚕茧生产损失。其中近70%的损失是由病毒性疾病是引起的,而作为蚕业上危害最严重且最常见的一类病原微生物家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus, BmNPV),由其引发的家蚕血液型脓病是目前蚕业生产上最为常见和危害最为严重的蚕病,每年给蚕桑业造成的经济损失之巨大。然而关于家蚕核型多角体病毒防治的相关研究截止目前仍未取得突破性进展,唯一的防控方法是清洁养蚕环境,一旦发生BmNPV感染,几乎所有被感染的蚕都会死亡。目前与家蚕病毒感染相关的基因,通过分子生物学等方法分离与鉴定出的还很少。而这少数鉴定出的基因还很难用来解析家蚕抗病毒的机制。因此,寻找宿主细胞中与病毒感染密切相关的应答基因,阐明它们的表达机制及其作用机理,对研究家蚕抗病毒机制具有重大的科学理论意义,对开展家蚕病毒病的防治也具有实际应用价值。本研究在BmNPV敏感性细胞系BmN-SWU1和抗性细胞系BmN-SWU2的基因芯片及蛋白组数据进行分析和筛选的基础上,选定BmGBP作为候选基因,并对其抗BmNPV的功能进行研究。主要研究结果如下:(1)家蚕BmGBP基因的cDNA克隆及序列分析我们成功克隆了家蚕BmGBP基因,全长cDNA为2310bp,其ORF框长度为2310bp,编码770个氨基酸,预测的蛋白分子量大小为88.2kDa。在家蚕数据库中的比对结果显示家蚕BmGBP基因位于第5号染色体上。该基因在基因组上总长度为12.41kb,由13个外显子和12个内含子组成。蛋白结构预测发现家蚕BmGBP蛋白具备典型的GBP结构域,系统发生树结果显示BmGBP基因与p65GBP聚为一类,由此我们推断该基因属于GTPase超家族。(2)家蚕BmGBP基因的原核表达及抗体制备我们将BmGBP基因编码区包含功能结构域的部分序列亚克隆到pET32表达载体上,对测序正确的重组质粒进行原核表达,并将表达产物进行western blotting验证。结果显示已成功表达了目的蛋白。最后对诱导表达的目的蛋白进行纯化,利用纯化后的BmGBP蛋白,免疫新西兰白兔4次后得到浓度为0.55mg/ml的多克隆抗体,而且通过western blotting检测制得的抗体特异性好,可用于后续实验。(3) BmGBP基因影响BmNPV复制的功能初探前期在mRNA水平检测了易感细胞系BmN-SWU1与抗性细胞系BmN-SWU2中BmGBP基因的表达量,结果显示在mRNA水平抗性细胞系BmN-SWU2中,BmGBP基因的表达量较于易感细胞系BmN-SWU1高出约20万倍。而在蛋白水平的检测结果也显示BmGBP蛋白在抗性细胞系BmN-SWU2中高量表达,易感细胞系BmN-SWU1中检测不到BmGBP蛋白。本研究成功构建了BmGBP/pIZv5-his、BmGBP/pIZv5-DsRed两个真核表达重组质粒。将重组质粒转染到易感细胞系BmN-SWU1中过表达后通过免疫荧光检测外源性BmGBP蛋白在感染BmNPV前后的亚细胞定位变化情况,结果发现在未感染BmNPV时外源性BmGBP蛋白分布于整个细胞,而在感染BmNPV后外源性BmGBP蛋白分布在胞质中,细胞核中的BmGBP蛋白向胞质中转移。而抗性细胞系BmN-SWU2中的内源性BmGBP蛋白在感染BmNPV前后无变化,都分布在细胞膜上。这些结果表明BmGBP蛋白可能是通过阻止BmNPV进入细胞或者细胞核来行使一定的功能。另外将pIZv5-DsRed空载和BmGBP/pIZv5-DsRed重组质粒转染易感细胞系BmN-SWU1,再用BmNPV感染,分别收集病毒感染后6h、12h、24h及48h各个时间点的BmN-SWU1细胞用于RNA和蛋白的提取。通过QRT-PCR检测了IE1、VP39、P10三个BmNPV复制必须基因的转录,检测结果表明,与对照相比过表达了BmGBP蛋白的BmN-SWU1细胞中IE1、VP39、P10三个基因的mRNA水平表达量显著降低。蛋白水平的检测结果也表明了BmGBP蛋白的BmN-SWU1细胞中BmNPV蛋白表达量与对照相比呈显著降低。此结果表明家蚕BmGBP基因对BmNPV的复制有抑制作用。同时,本实验对BmGBP基因进行C段和N端的截短表达并用BmNPV感染,mRNA水平及蛋白水平的检测结果都表明两种截短后的蛋白对BmNPV复制的抑制效果比完整的BmGBP蛋白差,而且它的抑制效果主要表现在BmNPV复制的早期,到了BmNPV复制的晚期和极晚期几乎没有抑制作用。这可能原因是两种截断的蛋白过表达量不及完整BmGBP蛋白,另一种可能是BmGBP基因的C端功能域与N端功能结构域共同行使对BmNPV复制增殖的抑制功能。本研究检测了BmNPV易感家蚕品系871和抗性家蚕品系871C五龄三天中肠组织中BmGBP基因在RNA水平的表达情况。结果显示两个家蚕品系中肠组织中BmGBP基因的表达量差异不显著。由于BmGBP基因在中肠中的表达量要显著高于其它组织,因此又进一步检测了两个家蚕品系在注射BmNPV后的一至四天中肠组织中BmGBP基因的表达变化情况,结果表明与对照相比易感家蚕品系871中肠组织中BmGBP基因的表达量呈显著下降,而抗性家蚕品系871C总体呈上调趋势。由此推测BmGBP基因可能是易感家蚕品系871和抗性家蚕品系871C对BmNPV敏感差异的原因之一,而这一猜测还有待后续实验的证明。


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