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家蚕同源异型突变体E~(Kh)的定位克隆及腹肢修饰基因的鉴定

付明月  
【摘要】:在昆虫进化过程中,附肢的出现为其更好地适应多变的环境提供了巨大的便利。昆虫的附肢可分为背侧附肢和腹侧附肢,其中背侧附肢仅包括翅及其衍生物,而腹侧附肢(简称腹肢)具有多种多样的特征,包括着生于头部的感觉器官触角,分布于胸腹部的运动器官足和用于交配、授精和产卵的外生殖器等。其中同源异型基因(Homeotic gene, Hox)作为昆虫躯体模式建立主要的调控基因,对腹肢发育的作用不容忽视。然而,已有研究表明不同昆虫中Hox基因对腹肢发育的作用不尽相同,因此单独研究某些昆虫中特定基因对腹肢修饰的作用是非常必要的。家蚕是重要的经济昆虫,具有丰富的遗传学研究材料,并且包括多种与正常腹肢相比具有明显差异的突变品系。因此可以利用这些具有相似腹肢突变表型的家蚕材料来研究家蚕中腹肢修饰基因。本研究以家蚕EKh突变体为材料,利用定位克隆技术鉴定其候选基因,进而研究候选基因与腹肢表型间的关系。随后,利用两个相似突变体ENk和EN突变进行表达谱测序,与正常野生型相比,共同出现表达量上调或下调的基因,可能包括了对腹肢表型发挥修饰作用的基因。获得的研究结果如下:1、家蚕EKh突变的表型分析野生型家蚕腹侧表型为在胸部T1,T3体节着生3对胸足,腹部A3-A6体节着生4对腹足,而且胸足与腹足的形态明显不同,胸足为分节状附肢,腹足则为肉质状突起;幼虫期背侧在A2环节具有一对半月纹,A5环节具有一对星状纹;成虫期只在胸部具有3对胸足。家蚕EKh突变属于家蚕E群突变的一员,其变异表型存在于胚胎期、幼虫期及成虫期。胚胎期,EKh突变体在A1环节形成过剩足,而且表型与胸足相似,A2体节偶尔可见过剩肢的形成;在幼虫期,过剩肢依然存在;在成虫期,极少数个体中可见成虫过剩肢的形成,即出现4对足。2、家蚕EKh突变位点的分子定位家蚕EKh突变位于家蚕经典连锁图谱第6连锁群21.1cM处,筛选现有的第6连锁群SSR标记引物发现在Dazao、EKh间均无多态性,因此设计新的引物筛选新的多态性标记。利用得到的多态性标记在定位群体中进行扩增,并统计结果,发现三个多态性标记(L1779、L1011和L1153)与突变紧密连锁,将家蚕Kh突变定位于标记L1048和L1391之间,约355kb的区域。通过信息分析,该候选区域内包括BmUbx第一外显子及BmabdA基因。因此,我们推测BmUbx基因和BmabdA基因为家蚕EKh突变体候选基因。3、家蚕EKh突变候选基因的表达分析克隆候选基因BmUbx基因及BmabdA基因,测序分析发现候选基因尽管存在单碱基突变,而所编码的氨基酸序列无任何改变。荧光定量PCR及Western blotting结果显示,EKh突变体中,候选基因BmUbx基因在mRNA和蛋白质水平上均比野生型显著下调表达,然而BmabdA基因则均显著上调表达。利用催青约60h的胚胎进行免疫荧光,结果表明BmUbx基因在野生型Dazao中主要表达于A1体节,然而在突变体中A1体节表达量下调;BmabdA基因正常表达于生长腹足的部位即A3-A6体节,促进该体节腹足的生长发育,然而EKh突变体中BmabdA基因异位表达于过剩肢形成的部位A1和A2。基于上述结果,我们推测BmabdA基因的异位表达促进了过剩肢的形成,该部位BmUbx基因的下调表达导致了过剩表型类似于胸足表型。4、家蚕腹肢表型修饰基因筛查上述研究结果显示BmUbx基因对腹肢表型的修饰具有重要作用。为了进一步了解家蚕腹肢的表型修饰基因,我们利用两个相似的E群突变体即ENk和EN突变及野生型N4作为材料,进行表达谱测序筛选腹肢修饰相关基因。ENk和EN在胚胎期均表现为在腹部每一体节均着生1对足,而且腹足表型与胸足表型相似。通过观察,发现催青约60h可以明显区分正常腹足和突变腹足,取该时期的胚胎腹部节段提取RNA后进行表达谱测序。与野生型N4相比,在两种突变体中筛选得到102个均明显上调表达的基因和123个均明显下调表达的基因,通过功能分析,这些差异表达的基因中包括了一些与体节分化及器官的细分相关的基因,同时还包括了部分在脊椎动物中已经证明与手脚发育相关的基因,以及已经鉴定与腹肢远端发育相关的基因等。我们推测这些基因可能参与了家蚕胸足、腹足的表型修饰过程。5、家蚕腹肢表型修饰基因鉴定Dll基因参与果蝇腹肢远端的发育过程,并且在胸部与腹部间表达时期和表达方式均存在较大的差异。利用表达谱测序相同的材料进行荧光定量PCR,相比于野生型N4,Dll基因在ENk和EN突变体中均具有上调表达的趋势。在催青48h的胚胎中进行免疫荧光染色,Dl1蛋白在正常胸足和腹足中表达时期和表达方式差异明显,而且在ENk和EN的变异腹足中Dl1蛋白的表达模式与正常胸足中相似。因此我们推测在家蚕中Dll基因可能参与了胸足、腹足间表型差异的形成。


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