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大叶麻竹笋多糖的分离纯化和鉴定

吴金松  
【摘要】:竹笋(Bamboo shoot)是禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)植物的新生芽,一直以来以高纤维、低脂、营养丰富的“素食第一品”著称;大叶麻竹(Dendrocalamus latiflorus)是中国产笋量最高的品种之一,具有较高的营养价值竹笋多糖是从竹类资源中提取到的一类活性多糖,它具有多种生物活性,比如抗氧化、抗肿瘤、降血糖等等。目前国内外关于竹笋多糖的研究报道较少,本文拟通过对大叶麻竹笋多糖的提取、分离纯化工艺及其结构的探究,从而为大叶麻竹笋资源的综合开发利用奠定初步的实验基础。本文以重庆产大叶麻竹笋为原料,分别对竹笋粗多糖的提取工艺、分离纯化工艺进行探究,对纯化后的多糖结构进行鉴定。提取工艺方面,拟选择正交实验优化水提醇沉法、响应面优化超声波辅助提取法和单因素优化酶法辅助法提取大叶麻竹笋粗多糖。分离纯化工艺方面,选择不同脱蛋白方法进行比较,得出较优的脱蛋白方法,再经过流水透析后进行DEAE-Cellufose52柱色谱和SephadexG-50葡聚糖凝胶柱色谱分级纯化,最后进行纯度鉴定。结构鉴定方面,先进行多糖理化性质分析,然后采用凝胶过滤法(GPC)测定其分子量大小,p-消除反应法结合氨基酸组分分析进行糖肽键联接方式分析,刚果红实验分析是否具有三股螺旋结构,气相色谱法分析单糖组成,红外光谱和核磁共振分析多糖构型等等。本文的主要研究结果如下:1、大叶麻竹笋多糖提取工艺的的研究(1)以烘干粉碎后的大叶麻竹笋粉为原料,采用水提醇沉法提取粗多糖,进行正交实验优化,由极差分析和方差分析可知,各因素影响的主次顺序为:乙醇终浓度料液比提取时间提取温度,最优提取工艺条件为:料液比为1:40,醇终浓度为80%,提取温度为80℃,提取时间为1h,提取2次,大叶麻竹笋粗多糖的提取率为2.09%。(2)通过响应面优化超声辅助提取大叶麻竹笋粗多糖,得出最优超声辅助提取工艺条件为:超声时间29min,超声功率400W,超声温度55℃,超声提取2次,80%乙醇终浓度沉淀,大叶麻竹笋粗多糖提取率2.49%。(3)通过考察中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶酶解辅助提取大叶麻竹笋粗多糖,可知中性蛋白酶对大叶麻竹笋粗多糖提取率影响最大;通过单因素变化法获得了较佳的中性蛋白酶辅助提取条件:提取温度45℃,pH值4.6,酶解60min,酶解2次,在80℃条件下水提60min,80%乙醇终浓度沉淀,提取率为2.89%。(4)通过比较以上3种大叶麻竹笋多糖提取工艺可知,水提醇沉法提取率最低,酶法辅助法提取率最高,但是提取周期较长,成本较高;超声波辅助提取时间较短,但提取率低于酶法辅助提取;从提取效率的角度考虑,宜选择超声波辅助提取工艺提取大叶麻竹笋多糖。2、大叶麻竹笋多糖纯化工艺的的研究(1)通过比较不同的脱蛋白工艺,木瓜蛋白酶结合Sevag法,多糖保留率为63.2%,蛋白去除率达到81.3%,多糖保留率和蛋白质去除率较高,是较优的脱蛋白工艺。由于大叶麻竹笋粗多糖溶液颜色为浅黄色,可以通过流水透析除去大部分色素。(2)DEAE纤维素阴离子交换柱初次纯化,以纯水、0.05mol/LNaC1、0.1mol/L NaC1、0.2mol/LNaC1、0.5mol/L NaCl (5个梯度)为洗脱液进行洗脱,得到5个洗脱峰。分别对吸收峰洗脱液进行浓缩冷冻干燥后,得到5个大叶麻竹笋多糖组分BSP1、BSP2、BSP3、BSP4、BSP5,其得率分别为19.3%、25.4%、29.6%、4.6%、2.2%。由于 BSP4、BSP5得率太低,而BSP1、BSP2、BSP3相对得率较高,所以将BSP1、BSP2、BSP3作为主要的洗脱组分进行下一步继续纯化。(3)Sephadex-50葡聚糖凝胶柱色谱再次纯化,BSP1、BSP2、BSP3均依次用纯水、0.05mol/L NaCl和0.1mol/L NaCl洗脱液洗脱。其中BSPl通过以上三种洗脱液洗脱获得BSP1A、BSP1B、BSP1C三种多糖组分,其得率分别为40.6%、8.5%、5.3%;BSP2通过以上三种洗脱液洗脱获得BSP2A、BSP2B、BSP2C三种多糖组分,其得率分别为47.9%、5.5%、9.8%;BSP3通过以上三种洗脱液洗脱获得BSP3A、BSP3B、BSP3C、BSP3D四种多糖组分,其得率分别为4.7%、53.4%、3.8%、5.9%。综合考虑,选择BSP1A、BSP2A、BSP3B为主要多糖组分进行后面的实验研究。(4)凝胶过滤和紫外全波段扫描进行纯度鉴定,测得BSP1A、BSP2A、BSP3B纯度分别为96.1%、95.3%、95.7%,鉴于紫外全波段扫描在260 nm和280 nm处均无明显吸收峰,从而可以判断BSP1A、BSP2A、BSP3B3种多糖组分是较纯的多糖物质。3、大叶麻竹笋多糖结构鉴定(1)大叶麻竹笋多糖基本理化性质的结果分析如下:大叶麻竹笋多糖组分(BSP1A、BSP2A、BSP3B)在水中溶解性一般,三种多糖组分在水中的溶解性依次为BSP3BBSP2ABSP1 A,不溶于常用有机溶剂;三种多糖组分均不含有多酚类物质、单糖、双糖及淀粉。大叶麻竹笋多糖组分BSP1A、BSP2A、BSP3B的总糖含量分别为95.3%、96.1%、95.7%;糖醛酸含量分别为1.8%、6.7%、7.6%;蛋白质含量分别为2.4%、1.8%、2.1%。葡聚糖凝胶法(GPC)测得BSP1A、BSP2A、BSP3B的分子量分别为10233Da、16982 Da、19952Da。(2)通过β-消除反应分析糖肽键链接方式,经过碱水解后的三种多糖溶液的紫外扫描图谱,在240nm处吸光度增加,结合碱解前后氨基酸数量的变化,可知三种大叶麻竹笋多糖均存在O-糖肽键(-O-Ser或-O-Thr)连接方式。通过刚果红实验,可以推断BSP1A、BSP2A、BSP3B均具有三股螺旋结构。(3)通过单糖组分分析,大叶麻竹笋多糖组分BSP1A由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖三种单糖组成,摩尔比为1:40.62:8.65;大叶麻竹笋多糖组分BSP2A和BSP3B均由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖四种单糖组成,摩尔比分别为5.43:1:2.87:10.37和6.57:1:3.69:12.08。(4)红外光谱分析结果表明,BSP2A和BSP3B具有β-D-吡喃型糖环,但BSP1A同时含有p-D-吡喃型和a-D-吡喃型糖环。(5)综合1H NMR口13C NMR谱图,可以确定BSP1A是一种以p-1,6-吡喃型葡萄糖为主要链接方式,并且有少量吡喃半乳糖和吡喃阿拉伯糖以1,6-糖苷键与之相连;BSP2A主要是←5)β-Ara(1→和→3)β-Gal(1→的连接方式,BSP3B主要是→3)β-Glu(1→和→3)β-Gal(1→的连接方式,还可能具有少量的其他糖苷键链接方式,有待于进一步的探究。


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