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灵菌红素抑制家蚕核型多角体病毒BmNPV核酸复制和基因表达的q-PCR分析

曾程  
【摘要】:家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus,BmNPV)属于杆状病毒科的一种环状双链超螺旋DNA(dsDNA)病毒。根据感染进程的不同,BmNPV呈现出两种不同的病毒粒子表型,即芽殖病毒(budded virus,BV)和包涵体病毒(occlusion-derived virus,ODV)。BV依赖囊膜融合蛋白GP64引起细胞间的感染,而ODV形成于感染晚期,包埋于稳定的蛋白结晶体中,主要造成家蚕个体间的感染。BmNPV病毒基因的表达以DNA的复制为界限可分为两个时期,即早期和晚期,分别又可细分为极早期、早期、晚期和极晚期。研究显示,极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10可以被用作marker基因来评估BmNPV的增殖过程。灵菌红素是具有三个吡咯环的微生物次生代谢产物,具有多种生物学活性。本实验室前期的研究发现灵菌红素具抑制Bm NPV增殖的作用。本研究以此为出发点,进一步论证灵菌红素的抗BmNPV病毒活性。主要的研究内容和实验结果如下:1灵菌红素对子代病毒BV的产生及包涵体病毒OB形成的影响收集病毒感染72 h后的培养基上清,采用空斑法测定BmNPV子代病毒滴度。结果显示,灵菌红素能显著地抑制子代病毒BV的产生。对照组子代病毒BV的产生量显著高于灵菌红素处理组,分别为100 nM灵菌红素处理组和10 nM灵菌红素处理组BV产生量的105和103倍。通过显微计数的方法计算形成包涵体OB的细胞数。统计结果显示,灵菌红素能够影响病毒包涵体在细胞中的形成。随着灵菌红素浓度的增加,形成包涵体的细胞数逐渐减少,当灵菌红素浓度为100 nM时,细胞中形成包涵体的细胞数仅为4.45%。2灵菌红素对病毒基因组DNA复制情况的影响利用q-PCR检测灵菌红素对病毒基因组DNA复制的影响。实验结果表明,随着BmNPV感染时间的增加,对照组病毒DNA增加显著,而灵菌红素处理组病毒DNA增加较缓慢,总量远低于对照组。其中,BmNPV感染48 h、72 h和96 h后,灵菌红素处理组病毒DNA总量仅分别为对照组病毒DNA总量的3.0%、1.3%和5.7%。研究结果表明,灵菌红素可显著地抑制Bm NPV病毒基因组DNA的复制。3灵菌红素对RNA转录情况的影响采用qRT-PCR技术检测灵菌红素对BmNPV基因转录表达的影响。结果显示,灵菌红素对BmNPV极早期基因ie-1、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录均有强烈的抑制作用。BmNPV感染72 h后,对照组病毒ie-1表达量约为灵菌红素处理组的55倍;灵菌红素处理组vp39的表达量只有对照组的1.1%;而灵菌红素处理组p10基因的表达量极低,几乎检测不出。4灵菌红素对GP64蛋白介导的细胞膜融合的影响弱酸性条件下,BmNPV表达的GP64蛋白可介导感染细胞发生膜融合。试验分别用低pH(pH 4.5)和细胞正常生长所需pH(pH 6.2)培养基短暂孵育BmNPV感染细胞,结果显示,对照组有合胞体的形成,而灵菌红素处理组中则没有合胞体的形成,表明灵菌红素可有效抑制BmNPV介导的膜融合。


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