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黑脉羊肚菌多酚提取物抗氧化及抗增殖活性研究

郑少杰  
【摘要】:本文以黑脉羊肚菌(Morchella angusticepes Peck)原料(以下以羊肚菌表示),对其进行体外模拟消化,分析消化过程中多酚及ORAC(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)的变化情况,以人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞Caco-2细胞为模型,对羊肚菌经体外模拟消化处理后的细胞毒性及抗增殖活性进行评价。采用细胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity,CAA)方法,以HepG2细胞为模型,从细胞水平上对羊肚菌经体外模拟消化处理后的细胞抗氧化活性进行评价,为羊肚菌功能活性及营养保健价值研究提供参考。以有机溶剂(丙酮)萃取、大孔吸附树脂纯化后的羊肚菌游离酚提取物孵育HepG2细胞和Caco-2细胞,对羊肚菌游离酚提取物的抗增殖作用进行评价,另外,通过测定羊肚菌游离酚提取物的细胞抗氧化活性、抗增殖活性及细胞内抗氧化、抗增殖相关酶和蛋白含量进行测定,进一步明确羊肚菌游离酚提取物抗氧化、抗增殖作用机制。主要结论如下:(1)体外模拟胃、肠消化对有利于羊肚菌多酚的释放及ORAC;细胞抗增殖活性结果表明:体外模拟胃消化处理不能明显抑制HepG2细胞增殖,肠消化处理对HepG2细胞有较强的抑制作用;对Caco-2细胞而言,除胃酸组、胃空白组外,胃0 h、胃液组、肠液组和肠空白组对Caco-2细胞的增殖均有较强的抑制作用;CAA结果显示,体外模拟胃消化处理的样品表现出促氧化作用,体外模拟肠消化处理的样品表现出抗氧化作用,并且抗氧化作用随着样品浓度的增大而增大;并且肠液0.5 h的CAA值(52.32±7.61μmol QE/g DW)强于肠空白0.5 h的CAA值(32.06±3.05μmol QE/g DW)。(2)羊肚菌游离酚提取物、结合酚提取物存在细胞抗氧化作用,其CAA值分别为26.60±5.35μmol QE/g DW、15.03±2.15μmol QE/g DW,且羊肚菌游离酚提取物、结合酚提取物的抗氧化活性存在一定的剂量效应,即随着羊肚菌游离酚提取物、结合酚提取物浓度的增大,其抗氧化活性越明显;其抗氧化作用可能与Nrf2-Keap1-ARE抗氧化信号通路有关,具体表现为:促进Nrf2蛋白的表达,使其进入细胞核启动ARE下游Ⅱ相解毒酶和细胞保护性蛋白基因转录,进而发挥抗氧化作用,保护细胞正常功能。(3)羊肚菌游离酚提取物可以有效的抑制HepG2细胞、Caco-2细胞的增殖,并且表现出明显的浓度剂量效应,即,随着羊肚菌游离酚提取物浓度的增大,其对HepG2细胞、Caco-2细胞增殖的抑制作用越明显,且羊肚菌游离酚提取物对HepG2细胞的增殖抑制作用优于对Caco-2细胞的增殖抑制作用;而羊肚菌结合酚提取物的抗增殖作用不明显。(4)羊肚菌游离酚酚提取物抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用机制可能和p38/MAPK信号通路有关,具体表现为:促进肝癌细胞HepG2内p21、p-ASK1、p-p38蛋白的表达,抑制p-p53、CDK4、Cyclin D1、PCNA、TRAF-2蛋白的表达,影响细胞周期的正常进行,抑制细胞增殖。促进肝癌细胞HepG2内Bax、Caspase-3蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,进一步诱导细胞凋亡。


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