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柑橘溃疡病菌hfq基因克隆与功能研究

严玉萍  
【摘要】:柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病是世界性的检疫病害,严重危害柑橘果实的品质,对世界柑橘产业构成巨大威胁。目前柑橘溃疡病的防控主要依赖化学防治,长期过度使用农药,不仅病原菌产生耐药性,而且影响果品安全、恶化生态环境。因此开展病原菌相关功能基因研究,解析病原菌致病机理,将为绿色防控技术研发奠定基础。随着2002年首个柑橘溃疡病菌全基因组序列的公布,有力促进病原菌中功能基因的相关研究。hfq基因编码的Hfq蛋白(Host Factor for RNA Phage Qβ)广泛存下于革兰氏阴性和阳性细菌中,作为分子伴侣与sRNA(Small Non-coding RNA)结合,参与基因的表达调控。已有研究表明,hfq有调节病原菌毒性、游动性、生长力、胞外酶形成等生物学功能,柑橘溃疡病菌hfq基因全长279bp,编码93个氨基酸。为了探究hfq基因在柑橘溃疡病菌中的作用,本研究构建2个致病力差异菌株(Xcc29-1和Xcc49)hfq基因的缺失突变体(29-1Δhfq和49Δhfq)与回补菌株(29-1Δhfq-C和49Δhfq-C)并进行生物学特性实验。初步明确hfq基因在柑橘溃疡病菌的生长代谢、生物膜形成、胞外酶及胞外多糖的形成、细菌的游动性、致病性等方面的影响。同时通过原核链转录组测序分析,进一步明确hfq基因在柑橘溃疡病菌中的功能。主要研究结果如下:1、分别扩增hfq基因上下游侧翼序列,连接到自杀载体pK18mobSacB,将获得的重组质粒电转入溃疡病菌的感受态细胞,优化同源重组筛选体系最终获得2个菌株的hfq基因缺失突变株。扩增含有启动子的hfq基因,连接到pBBR1MCS-5表达载体上,电转hfq突变株获得回补菌株。2、将野生型菌株、突变株、回补菌株三者同时进行生物学实验,结果发现,hfq基因的缺失突变株与野生型和回补菌株相比生长缓慢、游动性显著降低、胞外蛋白酶和胞外淀粉酶的产生也较低、生物膜的形成明显减少;同时对H2O2和pH胁迫较敏感;但突变株的胞外多糖、致病力等与野生型菌株和回补菌株无显著差异。生物学特性实验表明,hfq基因对柑橘溃疡病菌的生长、胞外酶的产生、细菌游动性、胁迫应答有重要作用,对致病力则无显著影响。3、为进一步明确hfq基因在柑橘溃疡病菌中的作用,对野生型菌株(Xcc29-1和Xcc49)以及突变株(29-1Δhfq和49Δhfq)进行原核链特异性转录组测序分析。结果显示29-1Δhfq相对于Xcc29-1有746个差异表达基因,其中662个基因下调表达,84个基因上调表达;49Δhfq相对于Xcc49有257个差异表达基因,其中172个基因下调,85个基因上调。突变体相对于野生型菌株下调的基因主要富集在趋化行为、群体感应、鞭毛组分、双组份系统以及分泌系统,上调基因主要分布在核糖体合成和分泌系统等途径。鞭毛组分和趋化性相关基因下调表达,结合hfq突变株在半固体培养基上游动性较弱,说明hfq基因参与调节柑橘溃疡病菌的运动相关基因的表达;群体感应中缺失hfq引起部分基因下调表达,表明该基因参与调控柑橘溃疡病菌群体感应;双组份系统在响应外界环境变化中有重要作用,其基因下调表达,结合突变体比野生型菌株对H2O2和pH更敏感,推测hfq基因可能在柑橘溃疡病菌的胁迫应答中发挥作用;核糖体是蛋白合成的场所,缺失hfq会引起大量核糖体相关基因上调表达,说明hfq可能参与调节柑橘溃疡病菌部分基因的转录后调控。4、转录组数据显示,野生型菌株Xcc29-1和Xcc49菌株在细菌II型和IV型分泌系统中存在大量差异表达基因,II型分泌系统分泌的酶类物质对植物的细胞壁有降解作用,IV型分泌系统可传递毒性相关DNA。推测两者致病力存在差异可能与这些基因的差异表达有关。


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