动物性食品中硝基呋喃类代谢物残留的定量免疫层析技术研究

【摘要】：食品安全问题一直是备受关注和亟待解决的焦点问题,与人们的身体健康息息相关,动物性食品安全是其中重要的一环。在畜禽和水产养殖中,硝基呋喃类抗菌药曾被广泛应用于防治动物疾病或促进动物生长,由于该类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎的副作用,全球多国已将其禁用于动物养殖,并在动物性食品中不得检出。常用的药物主要包括呋喃西林(nitrofurazone,NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantoin,NFT)、呋喃它酮(furaltadone,FTD)和呋喃唑酮(furazolidone,FZD)四种,该类药物在动物机体内代谢较快,其代谢物分别为氨基脲(semicarbazide,SEM)、1-氨基-2-内酰脲(1-aminohydantoin,AHD)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(3-amino-5-methylmorpholino-2-oxazolidinone,AMOZ)和3-氨基-2-唑烷基酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ),并和蛋白质结合稳定存在,因此通常利用代谢物的检测来反映硝基呋喃类药物的残留状况,欧盟和美国要求动物性食品中硝基呋喃类代谢物检测方法的最低要求性能限度(minimum required performance limit,MRPL)为1μg/kg。本论文开展动物性食品中硝基呋喃类代谢物残留的定量免疫层析技术研究,旨在为硝基呋喃类代谢物残留监控提供快速、灵敏、高效的检测手段。本论文使用2-硝基-5-羟基苯甲醛和4-溴丁酸乙酯取代水解反应后的产物对SEM进行衍生化处理,制备了免疫半抗原4-((3-苯甲醛缩氨基脲-硝基)苯酚基)丁酸(4-((3-benzaldehyde-semicarbazone-nitro)phenol)butyric acid,SEM-NP-BBA),基于4-羧基苯甲醛和SEM间的醛胺缩合反应制备了包被半抗原4-羧基苯甲醛缩氨基脲(4-carboxybenzaldehyde semicarbazone,4-CPSEM),通过活性酯法分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)偶联成功制备了呋喃西林代谢物免疫原和包被原,MALDI-TOF鉴定免疫原获得半抗原偶联比约为8.5。免疫BALB/c小鼠,基于杂交瘤技术制备出单克隆抗体SEM-9A6-F1,单抗亚型为IgG2a型,轻链为к型,经Protein A亲和柱纯化后浓度为4.25 mg/mL,间接竞争酶联免疫吸附测定结果显示抗体效价为1:27000,半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为0.013μg/L,与结构类似药物和畜禽、水产品中常见的残留药物均无交叉反应。本论文建立了检测动物性食品(鸡蛋、鸡肉、鱼和虾)中硝基呋喃类代谢物残留的背景荧光胶体金定量免疫层析方法(background fluorescence quenching immuno-chromatographic assay,bFQICA),结合便携式荧光免疫定量分析仪和内置标准曲线的二维码可实现现场快速定量检测。鸡蛋、鸡肉、鱼和虾中SEM的检测限(limit of detection,LOD)分别为0.09、0.10、0.12、0.15μg/kg;AHD的LOD分别为0.12、0.15、0.20、0.20μg/kg;AMOZ的LOD分别为0.15、0.15、0.20、0.20μg/kg;AOZ的LOD分别为0.07、0.10、0.10、0.15μg/kg。以LOD、2LOD、4LOD和1μg/kg添加空白动物样本时,日内添加回收率为73.7%~107.4%,变异系数为3.2~12.2%;日间添加回收率为75.7%~108.0%,变异系数为3.0~12.8%。在市售实际样本检测中,bFQICA与LC-MS/MS检测结果一致,表明该方法可以用于动物性食品中硝基呋喃代谢物残留的快速检测。本论文研究了高通量定量免疫层析技术,建立了同时检测动物性食品(鸡蛋、鸡肉、鱼和虾)中4种硝基呋喃代谢物残留的彩色乳胶微球免疫层析方法(latex beads immunochromatographic assay,LB-ICA),结合多通道免疫层析定量读数仪可实现快速同时定量检测。鸡蛋、鸡肉、鱼和虾中SEM的LOD分别为0.02、0.02、0.04、0.05μg/kg;AHD的LOD分别为0.04、0.05、0.08、0.07μg/kg;AMOZ的LOD分别为0.10、0.10、0.15、0.12μg/kg;AOZ的LOD分别为0.02、0.02、0.02、0.03μg/kg。以LOD、2LOD、4LOD和1μg/kg添加空白动物样本时,日内添加回收率为73.5%~109.2%,变异系数为3.5%~12.4%;日间添加回收率为75.8%~105.5%,变异系数为2.3%~12.9%。在市售实际样本检测中,LB-ICA与LC-MS/MS检测结果一致,表明该方法可以用于动物性食品中硝基呋喃类代谢物残留的高通量快速检测,为畜禽和水产品安全提供了强有力的保障。