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基于深度测序技术的柑桔衰退病毒新基因型鉴定研究

王骏  
【摘要】:由柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑桔衰退病是一种柑桔产业重要的经济性病害,已经造成至少上亿株柑橘植物的死亡。在田间,由于嫁接等农事操作和蚜虫的传播,柑桔衰退病引起快速死亡和茎陷点等症状,使得果实小,产量低,从而造成巨大的经济损失。柑桔衰退病具有复杂的株系分化和遗传多样性等特点,传统的检测方法难以获得病毒的全序列。转录组测序技术克服了这些障碍,可应用与柑桔衰退病以及其他未知病毒的检测与鉴定。本研究对柑桔衰退病枳分离株进行了高通量测序鉴定,对测序的结果进行RT-PCR验证,对获得的数据进行生物信息学分析,以期获得该CTV枳分离株的全序列,明确其基因型和在遗传进化中的关系,为后续基于全序列的研究奠定基础,其结果如下:1.转录组测序结果:对转录组测序获得的reads(200 nt)去除来源于寄主的片段后进行拼接,结果表明柑桔衰退病枳分离株中与病毒相关的contigs仅与两个CTV分离株具有较高的同源性,通过BLAXTx比对发现contig14与SY568(AF001623)同源性为87%,contig15与T36(EU937521)的同源性为89%,表明可能是两个CTV毒株混合侵染了枳。2.PCR验证:利用分段RT-PCR和RACE-PCR获得了2个CTV枳毒株(CN-L1-ZT1和CN-M1-ZT1)的全基因组序列,CN-L1-ZT1的基因组全长为19244nt,CN-M1-ZT1的基因组全长为19265nt。3.同源性比对:CN-L1-ZT1和CN-M1-ZT1两者之间的全基因组同源性为81.8%,后续序列比对表明,CN-L1-ZT1与美国苗黄分离株SY568(AF001623)在全基因组水平上同源性最高,为87.3%,与其他CTV基因型相似性在79.0%-86.9%之间。CN-M1-ZT1与美国佛罗里达T36基因型的同源性最高,为89.1%,与其他CTV基因型相似性在79.3%-88.9%之间。4.系统进化分析:运用MP和NN分析方法对已知CTV分离株进行全基因组系统进化分析,发现CN-L1-ZT1与CN-M1-ZT1明显区别于已知的CTV基因型而单独存在。MP分析显示CN-L1-ZT1单独聚为一簇,区别于现存的CTV基因型,靠近T30与A18之间;CN-M1-ZT1单独为一个亚簇靠近T36基因型。NN分析显示,CN-L1-ZT1和CN-M1-ZT1显著区别于其他序列群体,并不与已报道的CTV基因型聚在一起,而是单独的一个序列。利用NJ构建了CP和RdRp与已知CTV基因型分离株的进化树,结果显示,在CP核苷酸序列的进化树中,CN-L1-ZT1和CN-M1-ZT1不与其他已报道的CTV基因型混合在一起,两者单独聚为一个新的簇,表明可能有新的未报道的新基因型存在。在RdRp核苷酸序列的进化树中,CN-L1-ZT1单独聚为一簇,区别于现存的CTV基因型,靠近T3与S1;CN-M1-ZT1单独为一个亚簇靠近T36基因型,与全基因组系统进化分析结果一致。5.重组分析:将本研究中获得的2个CTV枳分离株与60个NCBI上已报道的分离株进行全基因组重组分析,检测到24个有意义的重组事件。CN-L1-ZT1作为重组序列,重组位点发生10700-19165nt,分别以VT(EU937519)和一条未知序列为主要和次要亲本,并且获得了全部算法的支持;而CN-M1-ZT1作为重组序列,重组位点发生在10793-19238nt,分别以FS674-T36(KC517485)和另外一条未知序作为主要和次要亲本,并且获得了全部算法的支持。6.基因型分类:根据国外研究关于CTV基因型分类的定义:当全基因组的相似性低于92.5%,ORF1a核苷酸与氨基酸序列相似性低于92%,且发生了同种或不同基因型之间的重组,则认定其是新的基因型。本研究中获得的两个CTV分离株满足上述分类标准。因此,推测CN-L1-ZT1与CN-M1-ZT1可能是两个新的CTV基因型,分别命名为L1与M1基因型。7.检测体系建立:根据p33区域核苷酸的差异性,设计引物用以鉴定L1与M1基因型,通过RT-PCR验证,建立了这两个CTV新基因型的检测体系。8.田间发生情况:田间通过田间调查发现重庆、四川、云南、广东、广西、贵州、湖南、湖北、福建、江西和浙江等地的柑桔样品具有较高的CTV感染率,为85.1%,但不同地区检出率存在差异。通过对检测出的阳性样品进行种群结果分析发现,几乎所有的样品都被多个CTV基因型混合侵染,这些CTV分离株中包含了所有已报道的CTV基因型,表明中国分离株具有复杂的种群结构。本研究中的L1与M1基因型只在16个重庆分离物中检测到,其原因可能是由于各地区采取的样品太少,也可能跟蚜虫活动范围有关。


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