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柑橘U-box基因家族的鉴定和CRISPR/Cas9编辑CcPUB4基因的研究

李秋月  
【摘要】:盐胁迫是世界范围内危害植物的主要逆境胁迫之一,严重抑制植物的生长和产量。柑橘是世界上以及我国南方重要的果树种类之一,属于对盐极敏感的甜土植物,在中国柑橘主产区经常出现盐害现象,在盐胁迫下植株表现出失绿、叶尖焦枯、枯枝落叶、品质变劣,甚至死树等症状(魏清江等,2015;Maas.,1993)。随着工业污染加重和化肥使用不当等人为因素的出现,盐碱土面积在不断增加,给柑橘生产带来了重大的威胁。所以挖掘出与盐胁迫相关基因,了解柑橘对盐胁迫的响应及适应性机制,培育出抗逆性品种对生产具有重要意义。U-box蛋白广泛存在于植物基因组中,其结构高度保守,在泛素降解途径中发挥E3泛素连接酶的作用(Smalle et al.,2004),在非生物胁迫响应过程中具有重要作用(Vierstra.,2009)。已有研究表明植物U-box蛋白(Plant U-box protein,PUB)通过调控盐胁迫响应基因的表达,提高植物体排Na~+和保K~+能力,维持体内的Na~+/K~+平衡,最终提高植物的耐盐性(李巧茹,2017)。因此,本研究对柑橘U-box基因家族进行生物信息学分析,包括基因结构、进化分析和诱导表达分析等,筛选到可能与盐胁迫相关的候选基因CcPUB4,同时为研究CcPUB4与抗逆性的关系,本研究针对CcPUB4基因构建了CRISPR/Cas9载体进行转基因功能验证,主要研究如下:(1)从柑橘克里曼丁(Citrus clementina)全基因组中鉴定出56个CcPUBs基因家族成员,可将其分为7类,即U-box only、U-box+ARM_1、U-box+WD40_1、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM_2和U-box+WD40_2,并在1-9号Scaffold上分布不均;该家族蛋白理论等电点和分子量等理化性质差异较大;启动子分析表明CcPUBs基因家族不仅响应光和干旱等外界环境还能应答激素的影响。(2)本研究通过对枳壳(Poncirus trifoliate Raf.)在冷胁迫下的RNA-Seq数据分析发现U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答,并表现出4种不同的应答模式(先下降再上升、先上升再下降、一直上升、一直下降);从柑橘U-box基因家族的5个不同簇上分别选取1个代表基因进行qRT-PCR,分析结果表明,U-box基因家族表达具有组织特异性并且能响应激素和非生物胁迫;CcPUB4受Na~+诱导表达并且其高表达在柑橘响应盐胁迫过程中有着重要作用。(3)CRISPR/Cas9技术已广泛应用于众多物种中,并取得了较高的编辑效率,为进一步确定CcPUB4与抗逆性的关系,针对CcPUB4通过在线与体外检测的方式设计合适的敲除靶点,构建了pP1C.1C-gRNA-1、pP1C.1C-gRNA-6和pP1C.1C-gRNA-1+gRNA-6三个载体,利用农杆菌介导法转化锦橙,获得了CcPUB4突变植株,主要发生碱基缺失;在线设计和体外酶切的方式设计gRNA能提高CRISPR/Cas9的编辑效率。


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