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朱砂叶螨抗药性相关羧酸酯酶基因鉴定及功能分析

魏朋  
【摘要】:化学防治一直是保护现代农业生态系统免遭有害生物侵袭的主要方法,而有害生物抗药性也给化学防治带来巨大的挑战。目前,世界上抗药性问题最突出的有害生物是叶螨,它们已经对96种化学农药产生了抗药性。拟除虫菊酯类和线粒体抑制剂类杀螨剂是两类重要的化学杀螨剂,因此研究害螨对拟除虫菊酯类和线粒体抑制剂类杀螨剂的抗药性机制对于两类杀螨剂的长效使用以及害螨抗药性综合治理具有重要意义。本论文以朱砂叶螨为研究对象,全面研究了羧酸酯酶基因对甲氰菊酯抗性和丁氟螨酯抗性形成的作用,鉴定出了抗药性相关的关键酯酶基因,并运用RNAi技术和蛋白表达技术明确了相关酯酶基因的功能,主要研究结果如下:1.生物测定和增效剂实验室内生物测定和增效剂实验结果表明:甲氰菊酯抗性品系(FeR)的抗性倍数为118倍,丁氟螨酯抗性品系(CyR)的抗性倍数为34倍。酯酶抑制剂DEF(脱叶磷,S,S,S-tributyl phosphorotrithioate)显著降低了FeR品系的抗性倍数,却明显提高了CyR品系的抗性倍数,表明酯酶均参与了朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯抗药性的形成,但扮演角色不同。2.酯酶粗酶活性检测离体酯酶活性检测结果表明:与SS品系相比,FeR品系和CyR品系体内酯酶活性均显著提高,进一步表明酯酶参与了朱砂叶螨抗药性的形成。3.酯酶基因表达量检测酯酶基因表达模式聚类分析结果显示:FeR抗性品系中存在四条过量表达且积极响应甲氰菊酯胁迫的酯酶基因(TcCCE06、TcCCE13、TcCCE15、TcCCE18),它们被视为参与朱砂叶螨甲氰菊酯抗性形成的关键酯酶基因。CyR品系中存在三条差异表达、能够响应丁氟螨酯胁迫的酯酶基因(TcCCE04、TcCCE12和TcCCE23);与FeR品系不同的是,上调酯酶基因(TcCCE04)受到丁氟螨酯胁迫后进一步上调而下调酯酶基因(TcCCE12和TcCCE23)在丁氟螨酯的胁迫下进一步下调,暗示出酯酶基因通过上调和下调的协同作用,促进朱砂叶螨丁氟螨酯抗药性的形成。4.RNAi验证关键酯酶基因体内功能RNAi干扰结果表明:甲氰菊酯抗性相关酯酶基因被沉默后(SS品系的沉默效率55-73%,FeR品系的沉默效率50-69%),SS品系体内酯酶活性降低了0.34-0.44倍,FeR品系体内酯酶活性降低了0.25-0.3倍;FeR品系对甲氰菊酯的抗性倍数也明显下降,其中,TcCCE06基因对FeR抗性倍数的影响最大(由118.5倍降至106.3倍),被选为后续功能研究的代表基因;丁氟螨酯抗性相关酯酶基因同样被有效沉默(SS品系的沉默效率64-80%,CyR品系的沉默效率55-64%),但沉默TcCCE04基因未显著改变朱砂叶螨对丁氟螨酯的敏感性,表明此基因与丁氟螨酯抗性形成关系不大;沉默TcCCE12和TcCCE23基因后,CyR品系对丁氟螨酯的抗性倍数从18.96倍降低至1.14倍和1.14倍,表明这2条下调酯酶基因可能对丁氟螨酯抗药性的形成具有重要作用。5.蛋白表达验证关键酯酶基因体外功能蛋白表达结果表明:甲氰菊酯抗性相关酯酶基因TcCCE06和丁氟螨酯抗性相关酯酶基因TcCCE12成功表达出活性蛋白,它们对酯酶特异底物1-NA(1-萘酚乙酯,273.5μM)的活性分别为22.6 nM/min/mg和128 nM/min/mg。甲氰菊酯能够竞争性抑制重组蛋白TcCCE06酯酶的活性,其IC_(50)为146.8μM;丁氟螨酯能够竞争性抑制TcCCE12酯酶的活性,其IC_(50)为97.9μM。此外,重组蛋白TcCCE06酯酶能够在3h内代谢41.79%的甲氰菊酯;重组蛋白TcCCE12酯酶能够在3h内代谢36.9%的丁氟螨酯,并伴有水解产物含量升高的结果。6.可变剪接可能是改变基因表达量的一种途径本研究首次发现羧酸酯酶基因存在可变剪接现象。TcCCE23基因具有三个外显子和两个内含子,其可变剪接发生于第一外显子末端,可变剪接序列具有GT-AG特征,长度为18bp,属于常见的5’可变剪接类型。此基因的两条变体(V1和V2)存在于朱砂叶螨SS,CyR和FeR品系中,不同品系基因变体序列无差异,但是它们的表达量却存在显著差异:FeR品系体内TcCCE23-V2的含量(93%)显著高于SS品系(71%)和CyR品系(73%),暗示出TcCCE23-V2含量的提高可能与甲氰菊酯抗药性形成有关。RNAi基因功能验证结果也证实了TcCCE23-V2表达量变化可影响朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性。除增加基因拷贝数和提高转录效率外,酯酶还可以通过可变剪接提高特异基因变体表达量参与抗药性的形成。


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