猕猴桃（Actinidia L.）荧光原位杂交技术体系的建立与优化

【摘要】：猕猴桃(Kiwifruit)属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl.),雌雄异株,为多年生攀缘性落叶藤本果树,是20世纪人工驯化栽培野生果树最为成功的四大果树种之一。猕猴桃属植物种类繁多,分布范围广泛,生态习性各异,含有大量的野生资源及近缘物种,具有较为复杂的遗传多样性,且由于自然杂交、实生选种和杂交育种等因素,使种间和种内的基因渐渗频繁,从而形成了极为丰富的种间变型和种内变型,因此猕猴桃属植物遗传多样性以及种间与种内亲缘关系的深入研究具有明显的重要性与必要性。当前,国内外学者运用形态学、孢粉学、细胞学、生物化学和分子生物学技术等从不同层次、不同方面、不同角度对猕猴桃属及其近缘野生种植物进行了大量的遗传多样性与亲缘关系研究分析,取得了重要进展。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)作为分子细胞遗传学一项重要的研究手段,在动植物遗传图谱构建、遗传多样性与亲缘关系分析、基因定位、杂种鉴定等方面具有广泛的应用,但由于猕猴桃属植物染色体小(0.6~1.5μm)且数目多(2n=58,116,174等),FISH技术在猕猴桃属植物研究方面几乎属于空白。本文选用当前主栽品种“红阳”(2n=2x=58)以及通过“红阳”与野生种毛花猕猴桃(A.eriantha Benth.,2n=2x=58)有性杂交人工创制杂种后代为试验材料,基因组DNA与45S rDNA为探针,分别对基因组原位杂交(Genome in situ hybridization,GISH)、45S rDNA-FISH以及DNA纤维原位杂交(Fiber-FISH)技术体系进行研究,系统建立适于猕猴桃染色体研究的染色体与DNA纤维原位杂交技术体系,为猕猴桃属植物遗传多样性与亲缘关系分析以及遗传图谱构建、基因定位与杂种后代鉴定等提供重要的研究途径,主要研究结果如下:1、GISH技术体系建立与优化对GISH技术体系中关键影响因子包括染色体变性与封阻DNA浓度2个重要技术环节进行了条件优化。采用分别变性即探针与染色体DNA分别变性的方法;探针DNA变性采用常规变性即PCR仪97℃反应10 min即可,而染色体变性很关键,变性温度与时间不足,DNA双螺旋不能完全解开,温度过高或时间过长,均可能导致染色体上的DNA会损失严重或过度膨胀造成脱落,导致杂交目标丢失或减少,通过对变性条件的筛选,认为70-75℃变性2 min均适宜于猕猴桃GISH染色体变性。以“红阳?猕猴桃基因组DNA为探针、毛花猕猴桃基因组DNA为封阻,通过不同封阻比例的筛选,认为封阻DNA浓度为探针的50倍最适于猕猴桃GISH分析,可有效区分出不同基因组来源,杂交信号清晰,背景干净。2、45S rDNA-FISH技术体系建立与优化在筛选优化染色体变性等主要技术步骤基础上,以“红阳”猕猴桃幼嫩根系为研究材料,45S rDNA为探针,对猕猴桃45S rDNA-FISH技术体系进行优化,主要对杂交后洗脱强度进行了比较筛选,认为相比GISH分析时42℃洗脱,45S rDNA这样的小片段DNA探针杂交后洗脱温度以37℃洗脱效果更佳,适于猕猴桃FISH分析,可获得背景干净、信号明显的杂交结果。3、Fiber-FISH技术体系建立与优化利用“红阳”猕猴桃幼嫩根系为试验材料,对细胞核提取、DNA纤维制备以及Fiber-FISH技术体系中关键影响因子包括DNA纤维变性、杂交后洗脱与衬染条件等进行了研究,主要结果如下:(1)细胞核提取采用“刀切法”较“液氮研磨法”效果更好,前者简便无毒,细胞核完整、无破损,提取率100%,后者操作复杂、有毒,且杂质多,细胞核易破损不完整,得率相对较低;(2)DNA纤维制备时对裂解液温育时间进行了筛选,设置5个反应梯度即分别温育10、15、20、25、30 min,结果表明20 min效果最好,获得的DNA纤维质量最佳,呈现平直、均匀且密度较大;(3)Fiber-FISH技术体系中,DNA纤维变性温度与时间分别严格控制在68℃变性2 min,杂交后洗脱温度以37℃洗脱2次最佳,另外,DNA纤维衬染时,DAPI浓度选择5μg/m L,染色时间为20 min效果最好。