甘薯（Ipomoea batatas Lam.）的遗传转化及转基因植株的性状变化

【摘要】： 甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam.］是重要的粮食和经济作物，但甘薯中蛋 白质含量低，蛋白质中氨基酸组成不平衡，尤其缺乏赖氨酸和甲硫氨酸两种人 体必需氨基酸。自八十年代以来，甘薯品质改良已逐步成为最重要的育种目标， 而蛋白质含量的提高及组成的改善已成为当前国内外甘薯品质育种的主攻方 向之一。本文以甘薯优良栽培品种为试材，对甘薯离体培养中的快速繁殖、根 癌农杆菌介导的离体遗传转化以及转基因植株的性状变化进行了研究，以期提 高甘薯遗传转化频率，获得不同品种转基因植株，并试图通过转基因植株的性 状变化探讨外源基因的表达情况以及外源遗传物质导入后对内源基因表达的 影响。 直观分析和方差分析结果表明，液体培养在甘薯离体培养中并不降低其生 长势，对甘薯不同品种无菌苗的生长有不同程度的促进作用，适合于快速繁殖。 液体培养20天对甘薯无菌苗的单株叶片数、单叶面积、叶柄长度影响不显著； 培养60天对单株叶片数有显著性影响，对单叶面积、叶柄长度、单株腋芽数 有影响，但不显著；结果还表明，液体培养对甘薯无菌苗株高的影响与甘薯基 因型有关。 依据高峰建立的甘薯离体遗传转化体系，本文采用如下离体遗传转化程 序：以甘薯茎切段为外植体，经3天预培养，用OD_(600)=0.3的根癌农杆菌菌液 西南师范大学 硕士学位论文 侵泡数分钟，光照条件下共培养3天，再经过5天延迟筛选，最后，在含75 mg八 Kan和 500 mg／L Carb的筛选培养基上再生成转基因植株，整个过程均以 MS＋ l．0 mg八AA为基础培养基。在该遗传转化程序的基础上，本文以甘薯多个 优良品种的茎切段为受体，以根癌农杆菌LBA4404巾（）Z菌株为工程菌，研 究了侵染时间、甘薯基因型、乙酚丁香酮、共培养培养基的PH、脯氨酸等多 种因素对甘薯离体遗传转化的影响。 结果表明，侵染时间对感染外植体的存活和分化影响很大。侵染时间过短， 不能让足够的农杆菌附着于外植体切口处，不利于以后的转化；时间过长，会 导致细菌的过度繁殖而使外植体褐化致死。在本试验条件下，根癌农杆菌侵染 甘薯茎切段外植体的时间，以 10～15min为宜。 试验结果表明，根癌农杆菌介导的甘薯离体遗传转化与甘薯的遗传背景有 关，不同摹因型之间Kan’芽获得率差别很大。南薯88获得Kan’芽频率较高， 为2．13％；南瑞Kanr芽获得率低，为0．87％；而岩薯5号则没有获得Kan’芽。 试验结果还表明，酚类物质AS处理能够诱导转化事件的发生，提高转化 频率；其诱导效果与pH有关，较低的pH环境更有利于转化的发生。用菌液 培养中加入AS进行活化处理的菌液侵染的外植体，经过一个月的筛选培养， 获得Kan’芽，获得率为 2．63％；而不加 AS的菌液侵染的外植体，经过一个月 的筛选培养，全部褐化死亡，没有获得Kan’芽。在共培养培养基中加入AS， ． 外植体经一个月的筛选培养获得 Kan’芽，获得率为 6．19％：个加 AS芹，全部 褐化死亡，没有获得 Kan’芽。共培养培养基中加入 AS后，pH值为 4．8时， Kan’芽获得率为9二6％；pH值为5．8时，Kan芽获得率为3．39％。 离体培养的甘薯转基因植株与对照植株可溶性蛋白质含量测定及分析结 果表明，叶片、叶柄、茎、根各器官中其含量有变化。在叶片、叶柄中转基因 植株蛋白质含量减少；在根中，转基因植株蛋白质含量增加。离体培养20大， 7 甘薯的遗传转化及转基因植株的性状变化 中文摘要 转基因植株根中水溶性蛋白质含量是对照植株的8＊ 倍，醇溶性蛋白质含量 是对照植株的4．30倍；离体培养45天，转基因植株根中水溶性蛋白质含量是 对照植株的1石0倍。两者可溶性蛋白质谱带分祈结果表明，在叶片、叶柄。 茎中可溶性蛋白质表现不同。而对同工酶的分祈结果则表明，两者在PER、 EST方面是一致的。 甘薯转基因植株与对照植株田间栽培苗形态观察结果表明，两者在叶片。 “根的形态以及色素沉积方面不同，而方差分析结果表明，两者的生长状况没有 显著性差异。 栽培苗可溶性蛋白质含量测定及分析结果表明，甘薯转基因植株在叶片。 叶柄、茎、根中水溶、盐溶、碱溶蛋白的含量均有不同程厦的增减，而醇溶蛋 白含量在所检测各器官中均有不同程度的增加，分别是对照植株的8．38倍。 l刀2倍、4石0倍、5l 9倍。转基因植株中醇溶蛋白含量的增加，与外源基因的 表达有关。简单蛋白含量