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甘薯“Ipomoea batatas L.(Lam.)”脱毒和离体遗传转化体系的优化与应用研究

陈永文  
【摘要】: 甘薯[Ipomoea batatas L.(Lam.)]是一种重要的粮食作物。目前发现病毒病害造成了其种质的退化,病毒病已成为甘薯产量进一步提高的限制因素。通过茎尖培养获得脱毒种苗是防治甘薯病毒病害和减缓种质退化的最为有效的措施。80年代以来,品质改良已经成为甘薯最主要的育种目标,特别是蛋白质含量的提高及氨基酸组成的改善已成为甘薯品质改良的主攻方向。 本文对影响甘薯脱毒的各种要素进行研究,并比较各种病毒检测技术的有效性与灵敏性。分析各种因素对根癌农杆菌介导的甘薯离体遗传转化的影响,优化甘薯离体遗传转化系统。将甘薯块根蛋白基因启动子(sporamin promoter,Psp)调控下的10kD玉米醇溶蛋白基因(10kD Zein gene,10kDZ)导入甘薯中,研究转基因甘薯植株中10kDZ基因的器官表达水平及产物积累方式,探讨甘薯块根蛋白基因启动子(Psp)的调控模式。并对转基因甘薯的主要农艺性状进行评价,分析外源基因对甘薯内源基因表达的影响。现将工作和结果报道如下: 1 甘薯良种脱毒种苗繁育体系的建立 利用茎尖培养技术,研究了不同的茎尖来源、激素种类的配比及甘薯的基因型等对成苗率的影响。试验结果表明,茎尖的分裂和分化能力可影响成苗率。薯块萌芽的茎尖较试管苗和大田苗的茎尖具有更强的分裂和分化能力,易于培养成苗,其成苗率最高,达到53.2%。培养基中激素的配比对成苗率影响显著。NAA、6-BA可提高甘薯茎尖成苗率,特别是NAA的浓度为1mgL~(-1)时,其成苗率达到最大值,为27.41%。甘薯基因型对成苗率有一定的影响,品种“南瑞苕”和“渝苏303”成苗率最高,分别为18.0%和12.0%,而“南薯88”和“岩薯5号”较低,仅为4.4%和2.0%。采用症状学法、指示植物法、酶联免疫法(NCM-ELISA)及RT-PCR法对甘薯拟脱毒苗进行了病毒检测。酶联免疫法检测结果表明,目前危害重庆市甘薯的病毒主要是甘薯羽状驳斑病毒(SPFMV)和甘薯浅隐病毒(SPLV)。脱毒与带毒试管苗的生长状况分析表明,病毒可阻碍甘薯植株的正常生长,尤其对植株高度、茎分节数及叶柄长度影响最大,脱毒植株比带毒植株高度平均高出63.16%。 西南师范大学硕士学位论文 计薯脱毒和离体遗传转化体系的优化与应用研究 2甘薯离体遗传转化系统优化的研究 以甘薯优良栽培品种为试材,农杆菌菌株为含有质粒PBI 121的Ng刁(携带GUS和 NPT-11基因)。试验卡那霉素(Kan)和头抱哗林钠(Cefazolin Sodium,Cef)对甘薯茎段外 植体不定根和不定芽分化的影响。分析菌液浓度、感染时间、预培养、共培养时间、a- 案乙酸州AA)、硝酸银M *及乙酚丁香酮(Acetosyringone,AS)等对根癌农杆菌 介导的遗传转化的影响,优化甘薯离体遗传转化系统。 试验结果表明,Kan可影响茎段外植体不定芽的分化,当 Kan浓度大于 80mgL‘时, 外植体不定芽的分化受到明显的抑制,因此,以 80mgL-’Kan浓度作为抗性芽分化的选 择压。抗生素Cef可影响农杆菌的繁殖和茎段外植体不定芽的分化。当Cefs浓度为500 mgL-’时,可有效地抑制农杆菌的繁殖但不影响外植体不定芽的分化。因此,本研究将 甘薯离体遗传转化的 Cef抑菌浓度确定为 500 mgL’。 观察和试验结果表明,菌液浓度太低(ODm0-0.2川,浸染时间在2~6min内,茎段 外植体分化出非转化的不定芽,3 次继代筛选后大多数不定芽死亡。当菌液浓度过高时 *Dm厂0.8卜 即使浸染时间很短u \ 常会因残留在外植体表面的根癌农杆菌生长 过旺,以至掩埋整个外植体,最终导致外植体褐化坏死。菌液浓度为0D60。一0.4,浸染时 间为4mill时,Kap’芽的获得率最大,为26.4%。因此,菌液浓度为OD60。一0.4,浸染时 间为4_1n为甘薯较适宜的感染浓度和浸染时间。 预培养和共培养时间对甘薯*一’芽的获得率也有影响。预培养时间短,筛选后获得 的Kan’芽的频率很低。预培养时间太长(5~7d),在预培养阶段,茎段外植体切口处的 细胞可分化出大量的不定芽,这将不利于随后的根癌农杆菌的侵染和 Kan’芽的获得。只 有预培养时间为3d后感染根癌农杆菌,3次筛选后其Kan’芽的获得率达到最大值,为 3 5.6%。因此,最理想的预培养时间为 3 d。 共培养时间对Kan’芽获得率也有影响,共培养时间太短,(‘0或 id),不利于外源基 因转移到受体细胞。共培养的时间为5或7 d时,导致茎段外植体周围的根癌农杆菌生 -长过旺,以致于掩埋整个外植体,造成部分外植体褐化死亡。共培养的时间为3d时,其 Kan’芽的获得率达最高值,35.8%。因此,最理想的共培养时间为3d。 预培养过程中 AgNO3有利于茎段外植体不定芽的分化,绝大多数不定芽在预培养阶段 被AgNO3诱导分化出来。经根癌农杆菌感染,共培养后外植体中分化?


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