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葱莲(Zephyranthes candida(Lindl.)Herb.)凝集素基因(zca)的克隆、序列分析、载体构建与转化

庞永珍  
【摘要】: 同翅目Homoptera害虫(如蚜虫,飞虱)是一类危害严重的昆虫,在吸食植物韧皮部的同时传播许多植物病毒,因此很难用传统的育种方法加以控制。迄今为止,通过人工喂饲实验已经证明从石蒜科克隆的凝集素基因对蚜虫和飞虱表现抑制作用,其中雪花莲凝集素(GNA,Galanthus nivalis agglutinin)已在植物基因工程中广泛应用,并对蚜虫和飞虱等表现出较好的抗性,而葱莲属于石蒜科,应该具有相似的凝集素基因因而可能在抗刺吸式害虫的基因工程中有良好的应用前景。 本实验采用cDNA末端快速扩增(RACE,rapid amplification of cDNA ends)技术,首次从石蒜科葱莲(又名玉帘,Zephyranthes candida (Lindl.)Herb.)的叶片中分离克隆出了一条新的凝集素基因,对该基因进行了序列分析和功能预测,成功地构建了该基因的植物表达载体,进行了转化研究,得到转基因的烟草和水稻。为今后研究该基因的功能表达及农作物抗虫基因工程的大田应用奠定了基础。具体的实验结果如下: 1.根据石蒜科(Amaryllidaceae)植物凝集素的保守区段,设计引物,采用RACE技术从葱莲中克隆出一条新的长度为647bp的凝集素基因,它包含了完整的编码序列(477bp),编码一个全长159个氨基酸的蛋白(已申请中国专利,公开号:1323887)。 2.对该基因所推导出的氨基酸进行了信号肽剪切位点、蛋白质结构域、高级 中英文摘要 结构和专一结合糖基化的分析;葱莲凝集素与雪花莲凝集素在蛋白质水平上的相 似性为 69%,核昔酸水平上的相似性为 76%,椎测此基因具有与 GNA相似的抗性 功能,同时通过分析葱莲凝集素与同属的另一个种韭莲凝集素也有一定的相似性, 为同源的凝集素基因。 3.在葱莲凝集素基因克隆的基础上,构建了植物双元高效表达载体p2301-ica, pl305-ica,并成功地导入到农杆菌EHA105中。 4.通过带有p230lzca质粒的农杆菌介导,采用叶盘法转化野生型烟草,经 二 PCR及 Western blot验证己成功地将 ica转入烟草中表达,抗虫实验正在进一步 的进行当中。 5.通过带有pl305-ica质粒的农杆菌介导转化成熟胚诱导的水稻品种鄂宜 105,对15株苗的PCR检测中有6株为阳性,另外的苗及进一步的分子检测正在 进行当中。


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