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基于结构分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的高通量药物筛选模型的构建与应用

柏冰  
【摘要】:结核病严重影响人类健康。潜伏期感染是其化疗疗程偏长、疗效不佳及化疗后再次复发的主要原因,也是结核病控制形势严峻的主要因素之一。异柠檬酸裂合酶(Isocitrate lyase,ICL)在结核菌的潜伏期致病中起至关重要作用,是一个潜在的药物靶标。它作为乙醛酸循环的第一个关键酶,催化异柠檬酸裂解生成琥珀酸和乙醛酸,从而改变碳源的流向,有利于碳源的积累,为结核菌在以脂肪酸或乙酸为碳源的环境下生长提供了有利条件。因此筛选新型的ICL抑制剂,有利于抗结核药物的开发。 本文通过PCR方法获得ICL的编码序列,克隆至原核表达载体pQE30;将重组质粒pICL-pQE30转化大肠杆菌JM109,优化可溶性重组蛋白的表达,Ni sepharose纯化可溶性重组蛋白。研究酶反应的线性范围以及反应时间,考察DMSO对ICL活力的影响,对测活条件进行优化,确定反应体系,并对高通量筛选模型进行评价。建立ICL抑制剂高通量筛选的标准化操作流程。对475个中药提取物进行筛选,初筛和双复孔复筛后,挑选抑制率大于50%的样品进行浓度梯度测定,计算IC_(50)。结果显示重组ICL基因工程菌构建成功,纯化方案简单可行,得到的重组ICL纯度达到90%以上,酶活力达到25676U/L,模型参数S/N和Z因子的值分别为12.7和0.72,说明该模型适用于高通量筛选。在对475种中药提取物的筛选中,筛选得到两种对ICL有明显抑制作用的中药XHD-1和XHD-2提取物,其IC_(50)分别为0.0477±0.0169和0.0182±0.0009mg/ml。对其进一步分离、纯化活性物质,可望获得抑制活性更强的重组结核分枝杆菌ICL的中药抑制剂,为抗结核药物的开发打下了良好的基础。


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