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嗜卷书虱谷胱甘肽S-转移酶生化毒理学特性及其cDNA片段克隆初探

豆威  
【摘要】:谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases)是生物体内广泛存在的一类重要解毒酶。它能够催化还原性谷胱甘肽的硫醇基与各种亲电化合物相结合,增加后者的可溶性从而有利于其从细胞内排出。作为杀虫剂抗性的一个重要机制,昆虫GSTs的研究主要基于杀虫剂抗性中的解毒代谢。本研究在教育部新世纪优秀人才支持计划(NECT-04-0854)资助下,以重要的储藏物害虫嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila Badonnel为试验材料,通过室内饲养并培育出嗜卷书虱的DDVP和PH_3抗性品系,较为系统地对两种抗性品系(DDVP-R和PH_3-R)与敏感品系体内的GSTs进行比较研究,主要结果如下: 首先,采用微量滴度酶标板法,对嗜卷书虱敏感品系和两个抗性品系GSTs的生化及毒理学特性进行了较为系统的研究。比较发现,两个抗性品系GSTs的活力和比活力都显著高于敏感品系(P<0.05),同时两抗性品系之间GSTs的活力和比活力也都达到了显著水平(P<0.05)。酶动力学特性研究表明,以CDNB为底物时,DDVP-R和PH_3-R品系中GSTs的K_m与敏感品系相比都显著下降(P<0.05),说明GSTs在抗性品系中发生了质变,导致其与CDNB的结合能力大幅提高,此外,DDVP-R品系中的V_(max)与敏感品系相比也有显著提高(P<0.05)。相对而言,以GSH为底物时,两个抗性品系K_m值与敏感品系相比均显著提高,且抗性品系间差异也达到显著水平;同时,DDVP-R品系中V_(max)大约是敏感品系的4倍,说明该抗性品系中GSTs对GSH的亲和力虽然下降,但是其可以通过V_(max)的提高来弥补亲和力下降所造成的损失。这些研究表明,与敏感品系相比,GSTs在DDVP-R和PH_3-R品系中都不同程度地过量表达。这种过表达是杀虫剂和熏蒸剂持续不断选择压力下筛选的结果。对嗜卷书虱GSTs的杀虫剂离体抑制研究表明,在所选用的四种杀虫剂中,对氧磷和敌敌畏对各品系嗜卷书虱GSIs都有明显的离体抑制作用(P<0.05)。说明在嗜卷书虱体内,GSTs是有机磷类杀虫剂敌敌畏和对氧磷的重要作用靶标,而且与敏感品系相比,两种抗性品系GSTs对敌敌畏表现为更不敏感。而氯氰菊酯对嗜卷书虱的抑制作用则相对不太明显。此外,低浓度毒死蜱(0.0002-0.0228μM)对各品系嗜卷书虱的GSTs均有明显离体激活作用,但高浓度毒死蜱(2.2825-22.8245μM)则对嗜卷书虱GSTs表现为一定的抑制作用。 其次,从分子水平上对嗜卷书虱GSTs的cDNA克隆进行了初步探讨。根据已发表物种Delta类GSTs氨基酸的保守序列,设计合成了针对Delta类GSTs的简并引物,以期进行RT-PCR,从而获得嗜卷书虱GSTs的cDNA克隆。结果得到一个cDNA片段:KTPGQAACLQVDDLSSMLNRRSLQGLVGTDIQASTDPRTICLRTVVISRNNDVQLAPT,对这段氨基酸残基用BLAST进行同源性分析发现,Blackcurrant reversion virus内有两个基因与本实验的扩增片段有33%同源性,比对中没有出现其他物种的GSTs基因序列。测序结果表明,扩增条带可能不是GSTs片段。说明引物的设计存在一定的问题,可能与GSTs在各个物种间


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