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家蚕微孢子(Nosema bombycis)全基因组结构与系统进化分析

许金山  
【摘要】: 微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内专性寄生原虫,在自然界已发现报道的微孢子虫有150个属,约1200余种,它们广泛寄生于脊椎动物和无脊椎动物,是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原。微孢子进化地位特殊,基因组组型、大小迥异,是研究物种进化的极好材料。家蚕微孢子虫是微孢子属的典型种,可专性寄生于经济昆虫家蚕而引发家蚕微粒子病,该病是家蚕的毁灭性病害之一,攻克微粒子病这一顽症,是蚕业界的重点和难点研究领域。但目前国内外有关家蚕微孢子虫的分子生物学研究极为薄弱,远未达到对家蚕微孢子虫深刻了解的程度。采用比较基因组学分析手段,从全基因组水平上对微孢子相关物种进行大规模、高通量、高精度的比较分析已成为该领域的研究热点之一,本世纪初兔脑炎微孢子全基因组精细图的公布,推动了微孢子基因组研究的深入发展,亦极大提高了人们对微孢子的理解和认识。本研究通过建立家蚕微孢子虫全基因组shotgun文库,大规模测序和组装后,获得了家蚕微孢子的全基因组框架图。通过对家蚕微孢子全基因组序列的比较基因组学分析,结合分子生物技术,着重从同源基因、基因复制和转座子重复序列三个方面出发,研究了家蚕微孢子的基因组结构特点,揭示了家蚕微孢子基因组在进化过程中的多样性和复杂化特征,探讨了家蚕微孢子乃至整个微孢子虫门的进化起源与历程。主要分析结果如下: 1.家蚕微孢子全基因组pUC18重组质粒文库的构建、测序与组装 通过大量收集家蚕微孢子CQ1分离株材料,提取基因组DNA后建立插入片段为1.5-2.0Kb的全基因组pUC18重组质粒文库,大规模测序后,获得了14.2万条的reads序列,碱基序列总读长达到了4.5倍的全基因组覆盖度。采用RePS软件对所有reads序列进行全基因组组装,结果获得了1096条scaffolds序列(长度在2Kb以上),其N50长度为32.6Kb。所有scaffolds的长度总和达到12.7Mb,其中最大一条scaffold长度为550Kb,这是首次构建完成的家蚕微孢子基因组序列图谱。 2.家蚕微孢子基因预测与基因进化特征分析 对家蚕微孢子全基因组序列进行了基因预测,鉴定得到了6356个家蚕微孢子基因。采用生物信息学分析方法,将家蚕微孢子、兔脑炎微孢子及酿酒酵母的三个物种全基因组基因进行相互比较,发现三者之间具有丰富的同源性基因。通过两两物种之间的同源基因的长度比较,发现家蚕微孢子和兔脑炎微孢子的基因长度相比酿酒酵母都显著变小,而且前者的变短趋势更加强烈,表明家蚕微孢子的全基因发生了一定程度的缩减,同时也说明在微孢子虫门的许多物种中普遍发生基因缩减现象。对家蚕微孢子和兔脑炎微孢子的同源基因在基因组上的排列位置进行比较,发现二者的基因排列顺序具有很强的共线性特征,有72%以上的同源性基因落入到共线性区段中,表明了微孢子的基因组进化相对真菌保守。同时在兔脑炎微孢子的每一条染色体上,都发现有大量家蚕微孢子的短片段的共线性区块存在,表明家蚕微孢子即充分保留了与兔脑炎微孢子分化之前的祖先基因组特征,也发生了许多基因组内重排事件。 通过近缘物种间的直系同源基因的变异程度分析,发现不同纲的微孢子虫之间的基因变异程度比较大,其中家蚕微孢子与兔脑炎微孢子之间的序列变异度小于家蚕微孢子与蝗虫微孢子之间。比较子囊菌门不同物种间的直系同源基因的变异程度,发现家蚕微孢子与兔脑炎微孢子之间的基因变异度接近并略小于酿酒酵母与裂殖酵母之间,参考酿酒酵母与裂殖酵母的分化时间,估计家蚕微孢子与兔脑炎微孢子在小于330-420百万年前发生了分化。 3.家蚕微孢子基因家族及基因复制特征研究 家蚕微孢子的多基因家族数量较多,其中双基因家族占到全部家族总数的71.2%。在特异性基因中,包含三个或三个以上基因成员的家族数目要远远大于共有性基因,这种差异表明家蚕微孢子为适应宿主环境的特异要求,更多的基因产生分化,形成了多基因家族。对同家族内的多基因进行比较分析,发现大多数基因之间序列高度相似(在氨基酸水平上相似性大于80%),表明家蚕微孢子基因组的许多基因发生了复制,而这种基因复制是形成家蚕微孢子多基因家族的重要原因之一。通过对基因复制的Ks值(同义替换率)分析,发现绝大部分的Ks值分布在很小数值区段内,即这些基因复制后发生同义替换的比率非常小,表明家蚕微孢子的基因复制集中发生在近期,推测在家蚕微孢子基因组的进化过程中,爆发过一次规模化的基因组复制事件。通过分析基因复制的Ka/Ks值(非同义替换率/同义替换率)分布,发现特异性基因复制后受到的纯化选择压力要小于共有性基因的复制,表明特异性基因复制后的分化更倾向于产生功能变异。可见家蚕微孢子的多基因家族与基因复制,无不与其寄生生活紧密相关,这些特征是家蚕微孢子在家蚕体内专性寄生的进化选择结果。 4.家蚕微孢子转座子结构分析,转录活性鉴定及系统进化分析 通过家蚕微孢子基因组检索,鉴定获得了12个Tc1-like(Tc1Nb)DNA转座子,1个piggyBac-like(NbPB1)DNA转座子和8个完整的LTR反转座子家族。所有Tc1Nb转座子的ITR序列末端包含有一段5碱基的保守基序,而转座酶区域具有普遍的D,D34E的催化中心,RT-PCR检测显示Tc1Nb6成员具有体内转录本,序列变异程度显示大部分Tc1Nb转座子的序列变异程度很低,而Tc1Nb6的变异程度相对更低。这些结果表明家蚕微孢子Tc1Nb6可能仍然具有活性,可以成为家蚕微孢子乃至微孢子门中一种新的、高效的基因转化载体。NbPB1转座子与家蚕的piggyBac-like转座子BmPBLE12具有极高的结构相似性,Southern杂交显示该转座子在家蚕微孢子中具有多个拷贝。系统聚类分析显示,NbPB1及其同源性转座酶与家蚕piggyBac-like转座酶最为接近。PiggyBac是一类广泛存在于昆虫基因组中的DNA转座子,我们的研究结果表明家蚕微孢子NbPB1是一类piggyBac-like转座子,而且是由家蚕水平转移而来,这是首次发现了piggyBac-like转座子能够存在于微孢子基因组当中。 鉴定得到8个完整的Nbr反转座子,系统发育分析发现它们均属于Ty3/gypia群,比较Nbr反转座酶与其他物种反转座酶的氨基酸同源性大小,发现家蚕微孢子反转座酶与真菌界中已报道的反转座子转座酶序列的相似性最高,支持了目前的关于微孢子与真菌最为接近的分类地位假说。考察Nbr反转座子在基因组中的分布特征,发现Nbr序列往往与DNA转座酶基因成蔟排列在一起,并处于两个共线性区块之间,起到打断共线性的作用,Ka/Ks的分析显示Nbr成员受到很强的负向选择压力。以上结果表明家蚕微孢子LTR反转座子是家蚕微孢子基因组重排的重要因素之一,并且在基因组中具有插入偏好性。


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