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化学发光微流动注射分析芯片的研究

刘伟  
【摘要】: 微流控芯片又称为芯片实验室,是把化学和生物领域中所涉及到的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(或更小)的芯片上,由微通道形成网络,以可控流体贯穿整个系统,用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台。其基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。微流动注射分析是微流控芯片技术的一个重要分支,是在流动注射分析的基础上发展而来的,具有整体化发展的优势,更加适合于现场分析,已经成为近年来分析科学领域内的一个研究热点。 本论文包括综述和研究报告两部分。综述部分包括三章,即第1-3章,主要涉及微流控芯片的发展概况、微流动的基本理论以及微流动注射分析的现状和发展方向。研究报告部分包括三章,即第4-6章。第4章中采用了双T进样、微阀进样以及改进的不连续微滴进样等几种不同进样方式对食品安全检测和环境分析用的微流动注射分析芯片进行了研究。这几种进样方式的使用大大减少了试剂的消耗体积,提高了测定的灵敏度和检出限。第5章中结合微固相萃取分离技术,通过在化学发光微流动注射芯片上在线富集分离实现了牛奶中β-内酰胺类抗生素的测定。第6章中将微流动注射分析芯片与微透析的取样技术相结合,活体在线测定了兔血中的葡萄糖含量以及金属离子铬在血液中的代谢情况。同时设计了一种可通过精确控制时间来控制进样体积的注射泵,时间控制精度为0.01秒,取样量为纳升至微升级。实验中无须外加采样环,保证每次的进样量为0.4μL,更好地实现了微透析的取样技术与微流动注射芯片的结合。 1.化学发光微流动注射芯片的研究 (1)测定面粉中过氧化苯甲酰的化学发光微流动注射分析芯片 过氧化苯甲酰是面粉中普遍使用的增白剂,它具有漂白和消毒的作用,但面粉中过量添加的过氧化苯甲酰却能引发一些过敏反应和增加致癌的可能性。本文基于PMMA化学发光芯片首次建立了测定面粉中过氧化苯甲酰的方法。芯片上微通道的宽为200μm,深为100μm,微通道的总长为67mm,检测区域面积为5×5mm~2。过氧化苯甲酰能够直接氧化鲁米诺产生化学发光,进样方式采用了两种,分别是双T进样和微阀进样。进样量分别为0.16μL和0.25μL。测定过氧化苯甲酰的线性范围是8×10~(-7)-1×10~(-4)gmL~(-1),方法的检出限是4×10~(-7)gmL~(-1)。两种进样方式的相对标准偏差分别为3.06%(双T)和2.41%(微阀)。该方法成功应用于面粉中过氧化苯甲酰的测定。 (2)测定自来水中次氯酸根的化学发光微流动注射分析芯片 Cl_2和ClO~-被广泛应用于自来水的消毒剂,然而使用ClO~-作为氯消毒剂会产生对人体有害的氯酸盐和亚氯酸盐。本文基于次氯酸根能够直接氧化鲁米诺产生化学发光的原理,结合微加工技术,建立了微流动注射化学发光检测系统测定自来水中次氯酸根的方法。微芯片是在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片(50mm×40mm×5mm)上通过激光雕刻微通道(宽为200μm,深为100μm)并结合双T的进样方式(进样量约为0.3μL)来实现的。该方法测定次氯酸根的线性范围是3.0×10~(-7)-1.0×10~(-4)gmL~(-1),方法的检出限是1.4×10~(-7)gmL~(-1)。11次平行测定的相对标准偏差为4.5%。方法简单、分析速度快(368 h~(-1))、耗样量少,已成功应用于自来水中次氯酸根的测定。 (3)用于快速测定水样中化学需氧量的化学发光微流动注射分析芯片 化学需氧量(COD)由于代表着水体中有机污染物的多少而成为水质检测的一项重要参数。因此需要低成本、简单的、快速的、试剂消耗量少的测定COD的方法以实现现场分析。本文建立了一种室温下快速测定化学需氧量(COD)的化学发光微流动分析芯片。基于样品在2 molL~(-1)H_2SO_4介质中被K_2Cr_2O_7还原为Cr~(3+),Cr~(3+)对luminol-H_2O_2化学发光体系具有催化作用来进行测定。芯片材质是聚甲基丙烯酸甲酯,采用的是不连续的微滴进样方式。考察了pH、试剂浓度、通道长度等对发光强度的影响。方法的线性范围为0.27-10 gL~(-1),检出限为100 mgL~(-1)。该方法成功应用于污水中COD的测定。 (4)用于水样中不同形态的铬的含量测定的化学发光微流动注射分析芯片 建立了一种同时测定水样中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的化学发光微流控芯片分析系统。基于Cr(Ⅵ)能够被H_2O_2在线还原为Cr(Ⅲ),Cr(Ⅲ)催化鲁米诺-H_2O_2产生强的化学发光来实现测定。制作微流控芯片的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),芯片采用的是微滴进样方式,进样体积为5μL。芯片上微通道的宽为200μm、深为100μm。线性范围分别为5×10~(-8)-1×10~(-5) molL~(-1)(Cr~(3+))和1×10~(-7)-1×10~(-5)molL~(-1)(Cr_2O_7~(2-)),检出限为2×10~(-8)mol L~(-1)(Cr~(3+))和4×10~(-8)mol L~(-1)(Cr_2O_7~(2-))。该法已经成功用于水样中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的同时测定。 2.微固相萃取分离-化学发光微流动注射芯片的研究 (5)用于牛奶中β-内酰胺类抗生素测定的在线同相萃取化学发光微流动注射分析芯片 β-内酰胺类药物也是牛奶样品中常用的抗生素,而牛奶中的抗生素残留问题已引起广泛的关注。SPE是常用的样品前处理和预富集的分析手段,具有高的选择性、易于操作和试剂消耗低的特点,将在线SPE分离技术用于共存物质干扰的消除是化学发光分析的一种理想的选择。本文建立了一种基于在线固相萃取技术的化学发光微流动注射分析芯片用于牛奶中四种β-内酰胺类抗生素(青霉素、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢氨苄)的测定。基于β-内酰胺类抗生素能够增强luminol-K_3Fe(CN)_6化学发光体系来进行测定。微流动注射分析芯片材料为聚甲基丙烯酸甲酯,其微通道的宽为200μm,深为150μm。C_(18)填装在微通道(长:10mm;宽:1mm;深:500μm)内作为固相萃取装置,微流动注射分析芯片在线完成分析物的萃取和富集,提高了化学发光检测的选择性。样品的检出限分别是青霉素0.5μg mL~(-1)、头孢拉定0.04μg mL~(-1)、头孢羟氨苄0.08μg mL~(-1)和头孢氨苄为0.1μg mL~(-1)。该方法已经成功应用于牛奶样品中β-内酰胺类抗生素的测定。 3.微流动注射分析芯片用于活体在线检测的研究 (6)微透析—微滴进样化学发光微流控芯片测定活体中的葡萄糖 微透析取样技术已成功用于活体分析,具有取样量少的特点,因此与微流动注射分析芯片的结合具有相当的优势。本文建立了在线微透析取样-化学发光微流控芯片测定活体中葡萄糖的方法。化学发光微流控芯片采用的是微滴进样方式,微滴形成于毛细管的尖端,其样品体积为4.5μL。制作微流控芯片的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),利用溶胶-凝胶固定化的方法将辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOD)固定在芯片微流通池的内表面上。葡萄糖被GOD氧化为D-葡萄糖酸和H_2O_2,H_2O_2在HRP的存在下氧化鲁米诺产生化学发光。使用微透析探针以20 h~(-1)的频率在兔子血液中采样,成功应用于在线测定兔子血样中的葡萄糖。 (7)微透析取样-化学发光微流动分析芯片活体在线监测血液中Cr(Ⅲ)的代谢 建立了微透析取样-化学发光微流动分析芯片系统用于活体在线监测家兔血液中Cr(Ⅲ)的代谢,基于Cr(Ⅲ)-luminol-H_2O_2体系来进行测定。在聚甲基丙烯酸甲酯的芯片上集成了阴离子交换微柱,芯片上微通道的宽为200μm,深为100μm。插在兔子耳缘静脉内的微透析探针连接的灌流液的流速为5μL min~(-1),微透析的样品体积为0.4μL,最终实现了兔子血液内Cr(Ⅲ)的代谢活体在位监测。


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