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丽格海棠快繁体系的建立和遗传转化初探

潘梅  
【摘要】: 本试验以丽格海棠(Begonia×Elatior)叶片、叶柄及茎段为外植体,通过诱导不定芽的形成,继而进行增殖培养,最后诱导生根、炼苗移栽,建立丽格海棠的快繁体系。以MS为基本培养基,研究了外植体类型,生长素、细胞分裂素配比对不定芽分化的影响,探索丽格海棠增殖培养适宜的激素配比;还对蔗糖与白砂糖的效果进行对比;最后,对丽格海棠试管苗生根的最佳培养基进行筛选。确定了丽格海棠组织培养的一系列技术参数组合,有效地提高了繁殖效率。在快繁体系的基础上进行了丽格海棠遗传转化方面的探索,以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导丽格海棠叶片。研究结果表明: ①丽格海棠外植体在6-BA0.2—2mg/L和NAA0.05—1mg/L均有不同程度的分化。说明在一定范围里,丽格海棠对激素的要求不是很严格,不同配比均可分化。以MS+BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L适宜的分化培养基; ②丽格海棠离体培养适宜的外植体类型为中度成熟叶片,其死亡率低、分化出芽快且分化率高,是适宜的外植体提供者。叶柄和茎段与叶片相比仅有少量芽的分化,在材料较少的情况下,利用叶柄、茎段作为外植体也是合适的; ③继代培养的时间不能超过60d,超过60d后继代苗有部分褐化死亡,30-40d继代既可有大量的有效苗又有较高的增殖率; ④优级白砂糖作为碳源对丽格海棠增殖生长以及生根的效果与分析纯蔗糖相比没有明显差异,从而可以利用白砂糖代替蔗糖来大大降低组培成本; ⑤丽格海棠试管苗生根较容易,不加任何激素的1/2MS培养基即可诱导其生根,但是所生的根比较细弱,NAA对其生根效果显著,丽格海棠试管苗生根适宜的培养基配方为:1/2MS+NAA0.05mg/L; ⑥在不添加蔗糖的生根培养基中丽格海棠组培苗所生根系与添加蔗糖的生根培养基中丽格海棠组培苗所生根系无明显差别,但是所长植株纤细,叶片薄弱颜色淡; ⑦丽格海棠对kan极其敏感,在筛选培养基与生根培养基中应选取较低的浓度;丽格海棠对Cef不敏感,因此在构建遗传转化体系时可以省去脱菌这一步,直接将共培养后的叶片直接接种到MS+500mg/L Cef+40mg/L Kan培养基中进行筛选培养; ⑧丽格海棠适宜的侵染时间为10min左右; ⑨经过3d预培养的外植体与未经预培养而直接侵染的外植体在分化时间、再生芽的频率没有明显差异,所以,为了缩短转化时间,丽格海棠转化可省去预培养; ⑩以丽格海棠的叶片为材料来进行遗传转化,进行GUS染色。未发现蓝色着色点,未将目的基因转入受体内,这和Sanae Kishimoto报道的试验结果一致。


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