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腊梅脂转移蛋白基因克隆与功能的初步分析

余国武  
【摘要】: 非特异脂转移蛋白是病程相关的蛋白。被定位在细胞膜上,在体外可以转运磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。抗菌实验表明具有抑制真菌、细菌生长的能力,同时可能具有抗虫害的潜力,大量的研究还表明非特异脂转移蛋白还参与蜡质形成等。因此研究非特异脂转移蛋白基因有重要的意义。非特异脂转移蛋白已从多种植物中分离得到,并通过生物技术克隆了大量的非特异脂转移蛋白的基因。从本实验室构建的蜡梅花cDNA文库中,利用EST技术从蜡梅中第一次克隆了两个非特异脂转移蛋白基因。通过生物信息学手段,对基因序列进行了分析和功能预测。为了进一步验证其可能的功能,构建了两个植物表达载体,通过烟草的转化获得了一批转基因植株,并对转基因植株进行了初步分析,主要研究及结果如下: 1、克隆子的获得 在文库中随机挑选克隆,提取质粒DNA,以文库克隆子质粒为模板,利用EST序列DW222703设计特异引物扩增出预计大小(388bp)的特异片段;利用EST序列DW223106设计特异引物扩增出预计大小(446bp)的特异片段,以文库克隆载体pTriplEx2引物对DW222703扩增出约613bp,对DW223106扩增出653bp的特异片段,经生物信息学分析、网上比对均显示,从文库中获得的CH0092的克隆子代表的基因为EST序列DW222703对应的全长cDNA。从文库中获得的CH001477的克隆子代表的基因为EST序列DW223106对应的全长cDNA。 2.序列分析 对两个目标基因进行了序列分析,两个基因分别由613和653个核苷酸组成,分别包含一个360和一个351个核苷酸的ORF,分别编码蛋白长119和116个氨基酸。两个基因编码的蛋白理论分子量分别为12.1kD和11.7kD,预测等电点分别为8.57和9.05。 3.表达载体的构建 两个nsLTPs基因均在克隆载体pTrip1Ex2上,将菌液活化并用X-balI和SmalI双酶切,最后连入表达载体PC2301上,酶切验证构建成功PC2301-nsLTP表达载体。 4.目的基因的转化和植株再生 采用叶盘法,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导分别将nsLTP92和nsLTP1477两个脂转移蛋白基因分别导入了烟草,各获得10多株转基因烟草。 5.转基因烟草的分子生物学鉴定 首先对筛选到的抗性植株进行GUS组织化学检测,初步表明基因转入并整合进烟草植株基因组中。然后对GUS染色呈阳性植株再进行PCR检测。结果表明GUS阳性株系均出现一条与刚性对照相同的特异带,而非转化植株则未得到该特异带。 6.转基因植株的抗蚜虫实验 对转基因nsLTP92和nsLTP1477植株的阳性株进行了蚜虫的抗性统计,方差分析表明当p=0.05时,编号为nsLTP92-1,nsLTP92-3,nsLTP92-4,nsLTP92-5的转基因植株蚜虫抗性分析与对照株有差异,而其他转基因植株与对照株均差异不显著,初步说明蜡梅基因nsLTP92可能具备抑制蚜虫的作用,而基因nsLTP1477则不具备抑制蚜虫的功能 7.转基因植株的田间观测 对转基因nsLTP92和nsLTP1477植株的阳性株和对照株在温室的生长状况进行了田间观测,发现对照株感染了烟草黑胫病,对黑胫病的发病状况进行了病情指数调查,发现分别转有nsLTP92和nsLTP1477基因的烟草植株和对照株感染黑胫病的病情指数不同。


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