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蜡梅的离体培养及其遗传转化体系的优化

曾静  
【摘要】: 蜡梅原名黄梅,是蜡梅科蜡梅属的落叶丛生灌木。蜡梅起源古老,种类较少,是第三纪孑遗植物和国家二级珍稀濒危植物。蜡梅是中国的传统名花,也是常用的园林绿化植物,它与梅花、山茶、水仙一起被称为“雪中四友”。蜡梅不仅具有较高的观赏性,还能作为经济植物、环保植物和药用植物被人们加以利用。虽然蜡梅的栽培历史悠久,但对它的开发研究利用主要是从20世纪80年代开始,且主要集中在国内,研究范围从宏观的种质资源、形态分类到微观的细胞学和分子生物学等内容均有涉及。近年来植物离体培养和遗传转化技术的发展,更为蜡梅的开发利用提供了新的途径。蜡梅常用的繁殖方法有嫁接、分株和播种繁殖,但这些常规繁殖技术要求严格,繁殖系数较低。通过离体培养,不仅可以对蜡梅能进行快繁及种质资源保存,同时也能为蜡梅的基因工程奠定基础。但相对于草本植物,木本植物的组培研究起步较晚并且不够深入,通过组培进行规模化生产的树种还比较少。作为一种木本花卉植物,蜡梅的组织培养存在着一定难度,比如它的再生分化比较困难,在组培过程中容易褐化等。而通过研究和建立蜡梅的遗传转化体系,则可以打破常规育种的限制,缩短育种年限,对蜡梅的抗性以及花色、花形等性状进行改良,培育出新品种,从而使蜡梅这一古老植物焕发出新的光彩。 目前国内有关蜡梅的组培报道主要集中在探索它的快繁技术上,未见通过分化建立蜡梅再生体系的报道,有关蜡梅遗传转化体系建立的研究也没有报道。本实验旨在采用蜡梅无菌苗子叶作为外植体诱导愈伤组织的形成与分化,并以此为基础初步建立并优化蜡梅的遗传转化体系。 (1)蜡梅的离体培养 以蜡梅种子无菌苗子叶作为外植体,以改良MS和MS作为基本培养基,添加不同激素组合,筛选出诱导蜡梅愈伤组织产生和分化的最佳培养基,建立起蜡梅的再生体系。将种子无菌苗半展开的子叶切成1cm×1cm的方块,接种于诱导培养基上进行愈伤组织的诱导和分化,再将分化出的芽切下接种于增殖培养基上进行增殖培养,待苗长到3~4cm高时,切掉基部愈伤,接于生根培养基中生根。实验结果表明,改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.2 mg/L+2,4-D0.2 mg/L能诱导蜡梅愈伤组织的产生和分化,分化率为11.7%;再生植株在改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上增殖系数最高,能达到2.7;1/2MS+NAA0.1mg/L能有效促进蜡梅生根,生根率在80%以上,而在未添加激素的1/2MS中蜡梅生根缓慢,生根率仅为10%。 (2)蜡梅遗传转化体系的初步建立及优化 以蜡梅的愈伤组织作为外植体,确定Cef,Km的筛选压,并利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将GUS基因转入蜡梅愈伤组织之中,初步建立起蜡梅的遗传转化体系。通过GUS基因瞬时表达的检测,探讨了农杆菌菌液浓度,侵染时间,不同类型侵染液,侵染液中AS的添加以及共培养时间对蜡梅转化的影响。结果表明以上因素是农杆菌介导的蜡梅遗传转化的重要影响因子。在农杆菌EHA105-pIG121介导转化蜡梅的体系中,Cef的筛选压为200mg/L,Km的筛选压为35mg/L,优化后的转化方法为:将蜡梅愈伤组织切成1cm×1 cm大小,在培养基改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+2,4-D0.2 mg/L上黑暗预培养3d。将第二次活化后OD_(600)值为0.4的农杆菌菌液离心后收集菌体,加入液体MS+AS100μmol/L,重悬到OD_(600)为0.4。将预培养后的愈伤组织置于重悬后的菌液中,在摇床上振荡侵染10min,在超净工作台上用灭菌滤纸将愈伤组织表面菌液吸干,再次接种于培养基改良MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+2,4-D0.2 mg/L中黑暗共培养2d。2d左右愈伤组织周围开始出现菌斑,此时,将愈伤组织放于液体MS+Cef1000 mg/L中脱菌2h,然后用无菌水冲洗愈伤5次,放于灭菌纸上将水吸干,然后接种于改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.2 mg/L+2,4-D0.2 mg/L+Km35 mg/L+Cef200 mg/L中进行筛选培养。在最佳优化条件下,蜡梅的GUS瞬时表达率为37.5%。


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