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鸭疫里默氏杆菌明胶水解酶部分特性研究

唐妤  
【摘要】: 鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鸭传染性浆膜炎是对当前养鸭业危害最大的传染病之一。该菌主要侵害易感动物心脏、肝脏、脾脏及大脑等组织,表现为全身浆膜纤维素性渗出,形成纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎与脑膜炎。病鸭多表现为眼鼻有分泌物,头颈歪斜,排褐色或黄白色稀粪,共济失调等,幸存者生长缓慢,甚至失去经济价值。国内外很多研究表明多种细菌分泌的具有水解明胶活性的胞外蛋白酶与致病性有密切关系,是重要的毒力因子。RA部分菌株具有液化明胶的特性,已有文献报道约50%的分离株能液化明胶,与我们的前期研究差异较大。本试验从RA液化明胶菌株流行调查入手,对液化明胶阳性菌株产液化明胶活性物质的影响因素、活性物质理化特性及活性物质对试验鸭的病理组织学影响进行了研究,为进一步研究RA胞外蛋白酶在其致病过程中的作用及RA的毒力因子奠定基础。本研究的主要结果如下: 1.建立了用于RA液化明胶菌株流行调查的营养明胶平板法,其具有简便、快速、直观的特点;分离鉴定的60株RA中有57株液化明胶,阳性率为95%。 2.通过超滤浓缩、65%饱和度的硫酸铵沉淀从RA液体培养物的上清液中提取明胶水解酶粗酶。14日龄鸭经颈静脉注射RA明胶水解酶粗酶1mL(相当于培养上清液140mL)后大部分表现为精神沉郁、脚软无力、嗜睡、部分伴有甩头、头颈歪斜等神经症状,并出现零星死亡;剖检可见肝脏出血、硬脑膜有出血点、大脑水肿、心脏有渗出、气囊增厚。病理组织学观察可见心肌纤维肿胀,有的呈现严重的颗粒变性,部分心肌细胞出现核溶解、核浓缩;大脑毛细血管扩张充血,毛细血管壁和脑组织间出现较大的间隙,毛细血管内皮细胞略为肿胀;肝细胞水泡变性明显,严重时几乎所有肝细胞胞浆中都出现大小不等的空泡;脾脏中央动脉血管内皮细胞肿胀明显,血管壁结构紊乱,脾小体内可见少量嗜酸性白细胞及较多红细胞。明胶液化阴性菌株对照则未见明显的临床症状及病理组织学变化。 3.RA不同菌株产明胶水解酶能力有一定差异,其中AF株产酶能力最强。AF株在LB液体培养基(含5mMCa~(2+))初始pH值7.4、装量10%,种子液接种量1.0%,37℃振摇(150rpm)培养24小时产明胶水解酶能力最强:在培养基中加入1%葡萄糖或蔗糖对RA明胶水解酶的产生有一定抑制作用。 4.RA明胶水解酶降解底物明胶的最适作用温度为37℃,最适作用pH值为8.0;该酶在50℃以下稳定,60℃0.5小时活力丧失50%以上,65℃0.5小时活力完全丧失;二价金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)及1mmol/L Zn~(2+)对粗酶有激活作用,5-10mmol/L Zn~(2+)对粗酶活性有一定抑制作用,Cu~(2+)对粗酶有强烈的抑制作用;金属螯合剂EDTA、EGTA及其他抑制剂2-ME、NBS、DEPC、乙酸酐对粗酶有一定抑制作用;EDTA和EGTA对粗酶活性抑制后,通过加入终浓度为20mM Ca~(2+)可以恢复20%的酶活力。


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