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间接ELISA检测鸭疫里默氏杆菌抗体方法的建立及应用

方钦  
【摘要】: 鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,简称RA)引起鸭的传染性浆膜炎(Infectiousserositis),是危害养鸭业最重要的病原之一。在生产实践中,现有的间接ELISA方法虽然能够检测出RA抗体,但不能区分是人工感染还是灭活疫苗免疫后产生的。本研究分别以RA菌体超声波裂解抗原、RA脂多糖抗原、原核表达CAM融合蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法,并应用于人工感染RA鸭恢复期血清和灭活疫苗免疫鸭血清抗体,为疫苗的研制及血清流行病学研究提供血清学检测的手段。研究结果如下: 1.本试验用pETCAM表达载体转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),用0.4mmol IPTG在30℃下诱导4小时后有最大表达量,通过Western Blot对表达蛋白进行了鉴定及利用His·Bind亲和柱层析纯化获得37kD左右的CAM融合蛋白。 2.间接ELISA方法的建立 (1)本试验以蛋白质浓度91ug/ml的菌体超声波裂解物作包被抗原,成功建立了检测RA抗体的间接ELISA方法(PRO-ELISA),其最适待检血清和兔抗鸭IgG血清的稀释倍数均为1∶800;对鸭抗多杀性巴氏杆菌、Ⅰ型鸭病毒性肝炎、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭瘟等血清的检测结果为阴性;阻断试验结果为阴性;板内和板间变异系数分别为3.86%-16.8%、6.17%-9.46%。 (2)本试验以多糖浓度为26ug/ml的脂多糖抗原作包被抗原,成功建立了检测RA抗体的间接ELISA方法(LPS-ELISA),其最适待检血清和兔抗鸭IgG血清的稀释度分别为1∶200、1∶400;对鸭抗多杀性巴氏杆菌、Ⅰ型鸭肝炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭瘟病毒等血清检测结果呈阴性;阻断试验结果为阴性;板内和板间变异系数分别为4.73%-6.90%、5.30%-11.9%。 (3)本试验以蛋白质浓度22.51ug/ml的CAM融合蛋白作包被抗原,成功建立了检测RA抗体的间接ELISA方法(CAM-ELISA),其最适待检血清和兔抗鸭IgG血清的稀释度分别为1∶400、1∶200;对鸭抗多杀性巴氏杆菌、Ⅰ型鸭肝炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭瘟病毒等阳性血清的检测结果呈阴性;阻断试验结果为阴性;板内和板间变异系数分别为5.85%-16.3%、4.22%-9.37%。 3.间接ELISA用于人工感染RA鸭恢复期血清和灭活疫苗免疫鸭血清抗体检测PRO-ELISA能从灭活疫苗免疫后第5天的鸭血清中检测到抗体(P/N=7.11);能从人工感染RA后第三天的鸭血清中检测出抗体(P/N=6.12),第21天抗体抗体水平达到高峰(P/N=17.26),随后抗体水平开始下降。 灭活疫苗免疫20天内的鸭血清利用LPS-ELISA不能检测到抗体(P/N<3),但二免后抗体水平迅速上升及第5天和第25天的抗体水平分别为4.25和9.34(P/N)。LPS-ELISA能从人工感染RA后第三天的鸭血清中检测出抗体(P/N=4.87),第21天抗体抗体水平达到高峰(P/N=17.04),随后抗体水平开始下降。 利用CAM-ELISA对灭活疫苗免疫一次后5-35天及加强免疫后5-25天的血清抗体进行了检测,结果均为阴性(P/N<3);人工感染RA后第三天的鸭血清中检测出抗体水平为4.98(P/N),第21天抗体抗体水平达到高峰(P/N=13.83),随后抗体水平开始下降。


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