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葛藤(Pueraria lobata)根瘤菌耐酸性研究

魏世清  
【摘要】: 我国酸性土壤分布广、面积大,分布遍及南方15个省区,总面积为2.03×10~7hm~2,约占全国土地总面积的21%。随着豆科牧草的种植范围不断扩大,南方种植牧草已成产业化的重要发展方向,但酸性土壤却成为牧草生长的限制因子,它使根瘤菌与宿主植物之间的亲和性降低,抑制根瘤菌的存活,致使豆科牧草生物固氮受阻。因此,在新开垦的酸性土壤上引种豆科牧草时,筛选并接种与之匹配的耐酸根瘤菌菌剂,对提高牧草的产量和品质极为重要。 葛藤[Pueraria lobata(Willd)Ohwi]是豆科葛藤属多年生草质藤本固氮植物,可在极其恶劣的土壤环境中快速繁殖,具有分布广、高产优质、抗逆性强、根瘤发达、固氮多等特征,是发展现代农业的理想农作物,增产潜力巨大;葛藤扎根深,根茎发达,具有很强的保持水土的能力,我国沙土面积大,可利用葛藤防风固沙进而改造成牧场或良田。葛藤能与根瘤菌建立共生关系,在南方酸性土壤的环境条件下,对于改善土壤结构,提高土壤肥力,保持水土,防风固沙,改变生态环境,在退耕还林、山川绿化中将能够发挥重要作用,使其在西南地区推广具有现实意义。 我国目前耐酸根瘤菌资源十分稀少,葛藤分布极广,适应性极强,无论中性和微酸性土壤都能生长,与其共生的根瘤菌也能从不同酸性土壤中被分离,易分离筛选获得耐酸根瘤菌。本试验对已有的葛藤根瘤菌耐酸性检测,对其耐受低酸环境的机制进行初步探讨,为进一步从分子水平上研究其耐酸机理提供参考,为葛藤的推广应用提供技术依据。 1.葛藤根瘤菌分离自重庆市北碚区缙云山酸性黄壤(pH4.6),其中接种PR390,葛藤根鲜重和植株鲜重分别提高537%、330%;结瘤率达到68.33%,并且瘤重和固氮酶活也较其他菌株高。PR390能在pH4.8固体培养基上生长,具有很强耐酸能力;酸性条件(pH4.6)对细胞大小和菌落直径产生了极显著影响。 2.将PR390接种至不同酸度培养液(pH7.0、5.5、5.0、4.8、4.6、4.4)中进行生长曲线的测定,结果表明,酸性抑制了根瘤菌的生长,酸性越低,根瘤菌生长越缓慢,表现为生长延滞期增长,对数生长期滞后,稳定期到达延迟,平均代时增长。PR390具有很强的耐酸能力,在pH4.6的YMA培养液中也能生长。根瘤菌生长对培养液pH的影响相似,都使培养液pH升高,最后趋于中性。 3 PR390在中性土壤悬液中生长最好,土壤悬液酸性降低,根瘤菌数目随之减少。在pH4.6的酸性土壤悬液中能够检测到根瘤菌数目的升高、降低变化趋势,酸性土壤悬液中根瘤菌生长高峰可达到5.43×10~7CFU/ml,说明在瘠薄的酸性土壤中PR390仍然能够存活生长,菌株具有很强的耐酸能力。 4为了探讨PR390的耐酸机制,检测了对其产生致死性危害的pH,发现在强酸性培养液(pH3.5)中几乎检测不到根瘤菌的存活;在pH3.3强酸冲击下,未经诱导的PR390胞外pH逐渐上升,最后升高到pH3.42,胞内所容纳的H~+能力很强,推测耐酸菌株利用一种耐酸机制能够将进入体内的质子中和,维持体内的中性环境;在pH5.0酸性诱导下,PR390具有最好的耐酸适应性反应(ATR),检测到胞外培养液pH几乎保持不变,PR390的存活率提高了46.39%,推测可能是特殊的细胞膜构造经过酸诱导后提高了对H~+的阻挡能力,因而提高了菌株的存活率。 5在pH4.6和pH7.0YMA培养液中接种PR390,开始检测时两种培养液中K~+浓度迅速上升,在随后检测时间内,胞外K~+浓度保持稳定,酸性条件下根瘤菌胞外K~+浓度为633mg/L,比中性条件高33mg/L。推测K~+在根瘤菌耐酸过程中发挥一定作用,可能是为了使胞内离子平衡,K~+流出,因而溶液中K~+浓度上升。 6在中性条件下,添加与不添加氯霉素两种处理后的LogCFU曲线几乎成两条平行线,PR390获得了自身生存的条件,同时对氯霉素具有一定抗性,即使添加氯霉素引起了细胞一系列新陈反应,但不足以影响其生长。在酸性条件下,与不添加氯霉素相比,添加氯霉素后溶液中的活菌数logCFU下降了2.62个数量级,下降时间提前了120min,加速了根瘤菌的死亡过程。推测可能是因为PR390在酸性环境中时,可能会诱导某种蛋白质,延长细胞在酸性环境的存活时间,而这种蛋白质受到氯霉素的抑制。 7葛藤种子很难获得,且发芽率很低,给实验室研究或人工种植葛藤带来不便。为了方便试验材料的获得,本论文还探讨了通过组织培养获得葛藤植株的方法和参数。以葛藤茎尖分生组织为外植体,通过不同激素与MS培养基配比试验,筛选出葛藤茎尖分生组织愈伤组织诱导与植株再生的最适培养基,建立葛藤植株再生体系。试验结果表明:茎尖分生组织在MS+2,4-D 0.5 mg/L培养基上启动诱导愈伤组织,再转移到MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L继续诱导,愈伤组织诱导率高,繁殖能力旺盛。在MS+6-BA 1mg/L培养基上愈伤组织分化率100%,生长能力较强。在MS+NAA 0.1mg/L培养基上,诱导生根率达到60%。


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