葛藤（Pueraria lobata）根瘤菌耐酸性研究

【摘要】： 我国酸性土壤分布广、面积大，分布遍及南方15个省区，总面积为2.03×10~7hm~2，约占全国土地总面积的21％。随着豆科牧草的种植范围不断扩大，南方种植牧草已成产业化的重要发展方向，但酸性土壤却成为牧草生长的限制因子，它使根瘤菌与宿主植物之间的亲和性降低，抑制根瘤菌的存活，致使豆科牧草生物固氮受阻。因此，在新开垦的酸性土壤上引种豆科牧草时，筛选并接种与之匹配的耐酸根瘤菌菌剂，对提高牧草的产量和品质极为重要。 葛藤[Pueraria lobata(Willd)Ohwi]是豆科葛藤属多年生草质藤本固氮植物，可在极其恶劣的土壤环境中快速繁殖，具有分布广、高产优质、抗逆性强、根瘤发达、固氮多等特征，是发展现代农业的理想农作物，增产潜力巨大；葛藤扎根深，根茎发达，具有很强的保持水土的能力，我国沙土面积大，可利用葛藤防风固沙进而改造成牧场或良田。葛藤能与根瘤菌建立共生关系，在南方酸性土壤的环境条件下，对于改善土壤结构，提高土壤肥力，保持水土，防风固沙，改变生态环境，在退耕还林、山川绿化中将能够发挥重要作用，使其在西南地区推广具有现实意义。 我国目前耐酸根瘤菌资源十分稀少，葛藤分布极广，适应性极强，无论中性和微酸性土壤都能生长，与其共生的根瘤菌也能从不同酸性土壤中被分离，易分离筛选获得耐酸根瘤菌。本试验对已有的葛藤根瘤菌耐酸性检测，对其耐受低酸环境的机制进行初步探讨，为进一步从分子水平上研究其耐酸机理提供参考，为葛藤的推广应用提供技术依据。 1．葛藤根瘤菌分离自重庆市北碚区缙云山酸性黄壤(pH4.6)，其中接种PR390，葛藤根鲜重和植株鲜重分别提高537％、330％；结瘤率达到68.33％，并且瘤重和固氮酶活也较其他菌株高。PR390能在pH4.8固体培养基上生长，具有很强耐酸能力；酸性条件(pH4.6)对细胞大小和菌落直径产生了极显著影响。 2．将PR390接种至不同酸度培养液(pH7.0、5.5、5.0、4.8、4.6、4.4)中进行生长曲线的测定，结果表明，酸性抑制了根瘤菌的生长，酸性越低，根瘤菌生长越缓慢，表现为生长延滞期增长，对数生长期滞后，稳定期到达延迟，平均代时增长。PR390具有很强的耐酸能力，在pH4.6的YMA培养液中也能生长。根瘤菌生长对培养液pH的影响相似，都使培养液pH升高，最后趋于中性。 3 PR390在中性土壤悬液中生长最好，土壤悬液酸性降低，根瘤菌数目随之减少。在pH4.6的酸性土壤悬液中能够检测到根瘤菌数目的升高、降低变化趋势，酸性土壤悬液中根瘤菌生长高峰可达到5.43×10~7CFU／ml，说明在瘠薄的酸性土壤中PR390仍然能够存活生长，菌株具有很强的耐酸能力。 4为了探讨PR390的耐酸机制，检测了对其产生致死性危害的pH，发现在强酸性培养液(pH3.5)中几乎检测不到根瘤菌的存活；在pH3.3强酸冲击下，未经诱导的PR390胞外pH逐渐上升，最后升高到pH3.42，胞内所容纳的H~+能力很强，推测耐酸菌株利用一种耐酸机制能够将进入体内的质子中和，维持体内的中性环境；在pH5.0酸性诱导下，PR390具有最好的耐酸适应性反应(ATR)，检测到胞外培养液pH几乎保持不变，PR390的存活率提高了46.39％，推测可能是特殊的细胞膜构造经过酸诱导后提高了对H~+的阻挡能力，因而提高了菌株的存活率。 5在pH4.6和pH7.0YMA培养液中接种PR390，开始检测时两种培养液中K~+浓度迅速上升，在随后检测时间内，胞外K~+浓度保持稳定，酸性条件下根瘤菌胞外K~+浓度为633mg／L，比中性条件高33mg／L。推测K~+在根瘤菌耐酸过程中发挥一定作用，可能是为了使胞内离子平衡，K~+流出，因而溶液中K~+浓度上升。 6在中性条件下，添加与不添加氯霉素两种处理后的LogCFU曲线几乎成两条平行线，PR390获得了自身生存的条件，同时对氯霉素具有一定抗性，即使添加氯霉素引起了细胞一系列新陈反应，但不足以影响其生长。在酸性条件下，与不添加氯霉素相比，添加氯霉素后溶液中的活菌数logCFU下降了2.62个数量级，下降时间提前了120min，加速了根瘤菌的死亡过程。推测可能是因为PR390在酸性环境中时，可能会诱导某种蛋白质，延长细胞在酸性环境的存活时间，而这种蛋白质受到氯霉素的抑制。 7葛藤种子很难获得，且发芽率很低，给实验室研究或人工种植葛藤带来不便。为了方便试验材料的获得，本论文还探讨了通过组织培养获得葛藤植株的方法和参数。以葛藤茎尖分生组织为外植体，通过不同激素与MS培养基配比试验，筛选出葛藤茎尖分生组织愈伤组织诱导与植株再生的最适培养基，建立葛藤植株再生体系。试验结果表明：茎尖分生组织在MS+2，4-D 0.5 mg／L培养基上启动诱导愈伤组织，再转移到MS+6-BA 0.5 mg／L+NAA 0.5 mg／L继续诱导，愈伤组织诱导率高，繁殖能力旺盛。在MS+6-BA 1mg／L培养基上愈伤组织分化率100％，生长能力较强。在MS+NAA 0.1mg／L培养基上，诱导生根率达到60％。