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嗜卷书虱乙酰胆碱酯酶生化毒理学及其基因克隆与序列分析

柴玉鑫  
【摘要】: 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE;EC 3.1.1.7)是生物神经传导中的一种关键性酶,能够迅速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱而保持神经突触传导的正常进行,是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标。害虫可以通过体内AChE质与量的变异而对杀虫剂产生抗性。为了阐明AChE在嗜卷书虱抗性中的作用和地位,以及AChE介导的抗性机理。本论文以重要的储粮害虫嗜卷书虱(Liposcelis bostrychophila Badonnel)为试验材料,通过室内饲养并培育出嗜卷书虱的DDVP和PH3抗性品系(DDVP-R和PH3-R),较为系统地对两种抗性品系与敏感品系体内的AChE,从生化毒理学以及基因克隆两个方面对其进行研究。主要结果如下: 一、嗜卷书虱AChE的生化毒理学特性 采用微量滴度酶标板法,对嗜卷书虱敏感品系以及2个抗性品系(DDVP-R,RF=22.36和PH_3-R,RF=4.51)AChE的生化毒理学特性进行了较为系统的研究。研究发现,嗜卷书虱敏感品系、DDVP-R和PH_3-R的酶源蛋白含量之间存在显著性差异,且2个抗性品系均显著低于敏感品系。DDVP-R和PH_3-RAChE的比活力显著高于敏感品系。酶动力学特性研究表明,以ATChI为底物,两个抗性品系的动力学参数之间存在显著的差异。PH_3-R的K_m值较敏感品系显著升高;同时,PH_3-R的V_(max)值显著大于敏感品系,说明该抗性品系的AChE发生了质的变化;同时,V_(max)的升高表明该抗性品系中可能存在AChE的过量表达。这种过表达可能是杀虫剂和熏蒸剂持续不断选择压力下筛选的结果。DDVP-R的K_m和V_(max)较敏感品系均无显著变化。 对嗜卷书虱AChE的杀虫剂离体抑制研究作用表明,所选用的六种杀虫剂对嗜卷书虱各品系AChE都有明显的离体抑制作用。根据测得的抑制中浓度(I_(50))可以看出,与敏感品系相比,2个抗性品系对于敌敌畏、对氧磷、马拉氧磷和甲基内吸磷的敏感性显著降低;PH_3-R对于西维因和毒扁豆碱的敏感性亦显著下降,而DDVP-R与敏感品系间无显著差异。以上研究结果表明,2个抗性品系都存在着对药剂的普遍不敏感性。 二、嗜卷书虱AChE基因的克隆 根据实验室已知的嗜卷书虱AChE cDNA片段设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),成功的从嗜卷书虱敏感品系中克隆到了编码AChE的全长基因,该基因全长2162bp,包括由181个核苷酸组成的5’非编码区序列、由1914个核苷酸组成的ORF和由67个核苷酸组成的3’非编码区序列。ORF编码637个氨基酸组成的AChE前体蛋白,其中包括了由20个氨基酸组成的信号肽。 三、嗜卷书虱AChE的同源性、功能位点、分子进化分析和同源建模 将嗜卷书虱AChE氨基酸序列提交到NCBI,进行蛋白质与蛋白质(BLASTP)同源比对,发现该序列同时具有Esterase-Iipase和COesterase的保守结构域,且具有完整的N端和C端。该序列与黑尾叶蝉Nephotetix cincticeps AChE的同源性最高,达到77%,与其他昆虫的AChE也都具有较高的同源性。 通过对嗜卷书虱、果蝇和电鳐AChE的氨基酸序列进行比对,发现克隆获得的嗜卷书虱AChE具有AChE家族所有的保守性功能位点:(1)保守的催化三联体S239,E368,H482(2)六个保守的半胱氨酸残基形成三对二硫键(C86-113,C293-308,C444-560);(3)保守的氧阴离子洞G151,G152,A240;(4)FGESAG序列。另外与电鳐乙酰胆碱酯酶相比,嗜卷书虱乙酰胆碱酯酶活性位点谷内排列的9个芳香族氨基酸残基是保守的(W103,W147,Y163,W272,W322,F331,F372,Y375,W474)。 从GenBank数据库中收集了来自31个物种的45个AChE氨基酸序列,结合嗜卷书虱的AChE氨基酸序列,利用MEGA3.0构建了AChE的分子进化树。结果表明用于分析的所有的AChE基本可以分为4个大的类群:昆虫AChE1类群、脊椎动物AChE类群、昆虫AChE2类群、线虫AChE类群。嗜卷书虱AChE基因为黑腹果蝇AChE基因的直向同源基因(orthologous gene),即Ⅱ型AChE基因。 以果蝇(1d×4A)AChE已知的蛋白晶体结构为模板,对嗜卷书虱的AChE进行了同源建模,得到的嗜卷书虱AChE的模拟三维结构模型,并对比电鳐的活性位点氨基酸,在结构中相应位置找到了嗜卷书虱AChE的酶解活性位点(催化三联体:Ser239,Glu368,His482)。


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