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赤拟谷盗乙酰胆碱酯酶生化毒理学特性及其cDNA片段的克隆

刘国瑛  
【摘要】: 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE;EC3.1.1.7)是生物神经传导中的一种关键性酶,能够迅速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱而保持神经突触传导的正常进行,是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标。为了阐明AChE在赤拟谷盗抗性中的作用和地位,以及AChE介导的抗性机理,本研究在教育部新世纪优秀人才支持计划(NECT-04-0854)资助下,以重要的储粮害虫赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst)为对象,较为系统地对2个抗性品系(HSTC-R和HYTC-R)与敏感品系(ABTC-S)10d龄幼虫、20d龄幼虫、蛹和成虫体内的AChE生化毒理学特性以及基因克隆2个方面进行研究,主要结果如下: 采用微量滴度酶标板法,对赤拟谷盗敏感品系(ABTC-S)以及2个抗性品系(河南商丘高抗品系HSTC-R,RF=248.11和河南益阳低抗品系HYTC-R,RF=2.49)10d龄幼虫、20d龄幼虫、蛹和成虫AChE的生化毒理学特性进行了较为系统的比较研究。结果表明,抗性品系(HYTC-R和HSTC-R)10d龄幼虫体内酶源蛋白含量显著高于敏感品系(ABTC-S)(P<0.05)。与敏感品系相比,2个抗性品系未成熟期(10d龄幼虫、20d龄幼虫和蛹)AChE的活力和比活力均显著降低(P<0.05)。酶动力学特性研究发现,高抗品系HSTC-R和低抗品系HYTC-R幼虫期(除HYTC-R品系10d龄幼虫外)AChE的K_m值显著升高,说明AChE在抗性品系中发生了质变,导致其与底物或杀虫剂的亲和力大幅度下降,而低抗品系HYTC-R 10d龄幼虫AChE的K_m值稍微略低于敏感品系,抗性品系蛹及成虫AChE的K_m值略有升高,但差异不显著:高抗品系HSTC-R未成熟期AChE的V_(max)值显著升高(P<0.05),说明HSTC-R抗性品系AChE的催化能力显著增强,而低抗品系HYTC-R各虫态AChE的V_(max)值较敏感品系虽略有升高,但差异不显著。5种抑制剂(毒扁豆碱、马拉氧磷、西维因、乙基对氧磷和甲基内吸磷)对赤拟谷盗3个品系10d龄幼虫、20d龄幼虫和蛹AChE离体抑制作用测定结果表明,2个抗性品系AChE对这些抑制剂的敏感度相对敏感品系均有所降低,且高抗品系HSTC-R对其更不敏感。总的看来,赤拟谷盗抗性品系AChE的结构发生了变化,导致其对杀虫剂的敏感性降低,这与赤拟谷盗抗性的产生关系密切。 根据已知昆虫(螨)AChE氨基酸保守序列设计合成适用于赤拟谷盗AChE基因扩增的引物,采用RT-PCR及克隆等分子生物学技术获得了赤拟谷盗2个cDNA片段,分别是:150bp(GenBank accession number:EF532798)和207 bp。150 bp片段推导的氨基酸序列为:EMWNPNTNISEDCLYLNIWVPQRLRIRHHGDKPPQERPKVPVLVWIYGGG;207bp片段推导的氨基酸序列为:EMWNPNTVPIPAPEPATPTVAAPAPINLAAESISLETGVVWKLLTAGRSVACLCCYDRTLDQCWVYGGG。150 bp cDNA片段推导的氨基酸序列与马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata,Q27677)AChE前体同源性最高,达90%;其次,苹果蠹蛾(Cydia pomonella,ABB76665)AChE2、家蚕(Bombyx mori,BAF33337)AChEⅠ型、小菜蛾(Plutella xylostella,AAL33820)AChE、烟青虫(Helicoverpa assulta,AAV65638)AChE和棉铃虫(H.armigera,AAM90333)AChE的同源性较高,且均达到88%,与脊椎动物电鳐(T.californica,P04058)AChE同源性达56%。同源性比较结果表明该序列与其他生物AChE相应氨基酸序列的同源性较高,而且该序列还含有AChE多个保守的特征性序列,说明该片段编码赤拟谷盗AChE的部分氨基酸序列。而207 bp cDNA片段推导的氨基酸序列与其他生物相应氨基酸序列进行同源性比对,没有出现其他物种的AChE基因序列,说明该片段不是赤拟谷盗AChE基因的部分序列。该片段可能是由于引物简并性较高而产生的非特异性扩增产物。 以上对赤拟谷盗HSTC-R和HYTC-R抗性品系以及敏感品系ABTC-S 10d龄幼虫、20d龄幼虫、蛹和成虫AChE生化毒理学特性的研究说明赤拟谷盗抗性的形成与AChE有关,这对于从理论上阐明赤拟谷盗抗药性的生理生化机理,赤拟谷盗对有机磷杀虫剂和无机磷杀虫剂抗性之间是否有交互抗性等问题,以及在实践上制订害虫综合治理、延缓抗性发展和抗性治理方案等均具有重要意义。此外,对赤拟谷盗AChE cDNA片段进行克隆和序列分析,为获取赤拟谷盗AChE基因全序列以及研究其变构AChE的分子机制奠定基础。这不仅在理论上深化对昆虫AChE分子毒理学特性的认识,充实生物进化及遗传变异的研究内容,在实践上将有可能建立相应的分子检测体系,且可以针对变化了的分子结构设计特定的靶标杀虫剂,从而促进我国新的杀虫剂分子设计和害虫综合治理新策略的制订。


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