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酶解发酵盾叶薯蓣皂苷元的提取及纯化研究

任雁  
【摘要】: 盾叶薯蓣(英文名Chinese Yam,拉丁名:Dioscorea Zingiberensis C.H.Wright)是我国特有种,又名火头(藤)根,苦良姜。薯蓣皂苷元(diosgenin)为白色晶体或粉末,有刺激性气味,难溶于水,易溶于苯、氯仿等有机溶剂,化学式及分子量:C_(27)H_(42)O_3,414.61,化学名称:(25~R)~Z-异螺旋甾烯-3β-醇,属异螺旋甾烯烷的衍生物,是薯蓣科薯蓣属植物根茎中薯蓣皂苷(dioscin)的水解产物。皂苷元具有多种生理功能,生物界称其为“生命的钥匙”,医药界称其为“药物黄金,激素之母”。 本试验以四川遵生药用植化有限公司出售的盾叶薯蓣为原料,对盾叶薯蓣的组成成分,常用盾叶薯蓣保藏方法进行了研究,对薯蓣皂苷元理化性质进行了定性判断,比较了传统皂苷元提取方法与酶解法,确定了盾叶薯蓣中皂苷元酶解法的最佳工艺条件。另外,考虑到超声波对薯蓣结构的影响,对比了超声波辅助提取法与超声-酶解法。最后,采用大孔树脂对皂苷元粗品进行精制,发现树脂ADS-7对皂苷元的吸附及解析较好,在一定程度上能有效的起到精制效果。主要研究结果如下: 1.测定盾叶薯蓣中各种成份,发现其中淀粉(26.99%)和粗纤维(57.7%)含量最大,皂苷含量约5.24%。因此选择淀粉酶,纤维素酶,复合酶进行酶解发酵,更具有理论依据。研究鲜盾叶薯蓣的保存方法,得出冷藏是一种可取的方法。 2.通过两种方法对皂苷元标准品及样品的扫描,可知硫酸-甲醇法较优,在414nm处出现单一峰。通过稳定性试验(RSD=4.49‰),精密度试验(RSD=6.34‰)及回收率试验(RSD=9.53‰),可知相对标准偏差较小,结果重现性好,精密度较高,所得数据精确。直接酸水解法最佳工艺:酸浓度为3mol/L,酸解时间为4h,发酵时间为24h,加水量为60mL(即料液比1∶3)。影响因素大小:酸的浓度>酸解时间>发酵时间>加水的量,所得皂苷元量为0.4108g 3.选择影响耐温淀粉酶四个主要因素,确定三个水平,得出最佳工艺参数:A_2B_3_C_3D_2,即pH为6,酶用量为0.1mL,酶作用温度为50℃,酶作用时间为36h。影响因素大小:酶作用温度>pH>酶用量>酶作用时间,所得皂苷元量为0.4935g,比直接酸解法提高了20.13%。 4.选择影响耐高温淀粉酶的四个主要因素,得出最佳工艺参数:A_3B_3C_3D_2,即pH为6,酶用量为0.1mL,温度为50℃,酶作用时间为24h,影响因素大小为:酶解温度>酶解时间>pH>酶用量,可得0.4999g皂苷元,比直接酸解法提高了21.69%。通过加酶与不加酶提取过程中几个参数的对比,可以看出,加酶后所得皂苷元量远大于不加酶组,且黄色废液中所得糖含量高,为绿色无污染糖,经酸解后两次得糖相差不大。分析酸用量与皂苷元,渣重,糖的关系,可知酶作用提取皂苷元,可以减少酸的用量(皂苷元得率达到直接发酵法提取得率时,可节约酸33.33%),降低污染。 5.将原材料经超声波处理后,索氏提取,未能明显得到皂苷元。超声后不加酶法与超声后加酶法所得皂苷元量基本相当,分别为0.4977g/20g粉末和0.4994 g/20g粉末,比直接发酵法分别提高了21.15%和21.56%。可见,超声能够一定程度上取代酶作用,但其发酵后糖量略有减少,绿色糖减少。考虑到超声波对人体的负作用,以及超声波法成本要远大于生物酶法,认为酶解发酵法较优。 6.从熔点及纯度来看,酶法所得皂苷元样品质量均要高于直接发酵法所得皂苷元。酶法所得皂苷元样品熔点大致在202-210℃,纯度均在88%以上,而直接水解法所得皂苷元样品熔点一般在198-205℃,纯度均低2个百分点。 7.树脂ADS-7对皂苷元的吸附作用很好,吸附率高达94.35%,用无水乙醇作为解析剂,可将其全部析出,说明它是一种很好的树脂。乙醇的解析作用很强,95%乙醇基本上能将所吸附的皂苷元全部解析下来。最终得出:8g预处理过的树脂ADS-7,加入200mL浓度为0.094mg/mL样品溶液,用数显恒流泵控制样液以1.0mL/min的速度流入装有树脂ADS-7的层析柱,待吸附完成后,收集吸附后的流出液,取1mL进行检测皂苷元含量,算出吸附量。将层析柱内树脂凉干(避免层析柱破裂),然后加入250mL解析剂,解析率可达到87.76%。收集解析液,检测皂苷元含量,算出皂苷元纯度为94.12%,比纯化前提高4.5%。


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