光谱法研究血清白蛋白及壳聚糖与染料的相互作用及分析应用

【摘要】： 荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、试样量少和方法简单等特点已成为一种常见的物质定性定量分析方法。本文研究了蛋白质与多种染料的相互作用及它们的光谱特征。并以计算结果阐释了荧光猝灭的类型，染料与蛋白质的作用力类型。并计算了体系的结合常数、结合位点数和结合距离等有关参数。实验发现染料与蛋白质作用后，其荧光猝灭程度与染料浓度呈线性关系，据此可建立分析测定染料的新方法；当改变实验条件时蛋白质与某些染料作用会导致染料荧光增强，其增强值与蛋白质的浓度呈正比，于是可建立分析测定蛋白质的新方法。 共振瑞利散射(RRS)法是近年来发展起来的操作简便、灵敏度高的分子光谱分析方法。目前RRS法已经广泛用于生物大分子分析、无机物和药物分析、痕量无机离子的测定和纳米离子的表征等方面的研究。我们将它应用于糖类物质的分析，建立了测定壳聚糖的RRS新方法，并研究了实验的条件和影响因素。方法用于壳聚糖的实际样品测定，结果令人满意，并与其它方法比较有更高的灵敏度和选择性。 1蛋白质-吩嗪类染料体系 在pH 7．4的Tris-HCl缓冲介质中牛血清白蛋白(BSA)及人血清白蛋白(HSA)与酚藏花红(PS)、中性红(NR)和番红花红(ST)吩嗪类染料发生结合反应。三种染料均导致了蛋白质的荧光猝灭，其荧光猝灭值与染料浓度成正比，可以蛋白质为探针，测定某些染料。由实验数据得到不同温度下的动态猝灭常数和静态猝灭结合常数、反应的热力学参数和结合位点数。根据F(?)ster能量转移原理计算出了三种染料与血清白蛋白20℃时的结合距离。同时研究了在pH 9．5的Tris-HCl缓冲溶液中蛋白质对PS荧光的增强作用。根据PS荧光增强程度与蛋白质浓度的线性关系，可用于蛋白质的含量测定。研究了牛血清白蛋白与中性红的三维荧光光谱，表明二者发生了能量转移，BSA将部分能量转移给NR，导致BSA的荧光猝灭。 2蛋白质-二苯基奈基甲烷类染料体系 用荧光光谱、同步荧光光谱和紫外吸收光谱法研究了BSA及HSA与维多利亚蓝(VB)、维多利亚蓝B(VBB)、维多利亚蓝4R(VB4R)等二苯基萘基甲烷类染料相互作用及光谱特征。结果表明染料与蛋白质的反应导致了蛋白质的荧光猝灭，其荧光猝灭值与VB、VBB、VB4R的浓度呈正比。用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk双倒数函数处理实验数据，得到不同温度下的动态猝灭常数和静态猝灭结合常数、反应的热力学参数和结合位点数。根据F(?)ster能量转移原理计算出了三种染料与血清白蛋白的结合距离。 3壳聚糖-金属离子-蛋白质体系 在pH 6．5的Britton-Robinson(BR)缓冲溶液中，HSA、铜离子和壳聚糖反应后形成三元复合物，导致体系的散射光强度显著增强。最大散射峰位于470 nm左右，而位于305～340 nm左右的散射峰强度最为稳定。在0.01～4.0μg／mL范围内散射强度与壳聚糖浓度呈线性关系。方法灵敏度高，检测限为3.7 ng／mL。该方法用于海虾、蟹等实际样品及胶囊中含量测定，结果满意。 4壳聚糖-四碘荧光素体系 在pH 4．0的BR缓冲溶液中，四碘荧光素与壳聚糖反应生成复合物导致共振瑞利散射光谱强度增强，最大RRS峰位于575 nm。研究了体系的适宜反应条件及共存物质的影响，根据其线性关系建立了测定壳聚糖的RRS新方法。线性范围是0.1～2.0μg／mL，检出限为17ng／mL。方法简便、快速，重复性好。可用于壳聚糖胶囊的测定。本法与第三体系中的研究方法均有较目前报道的荧光猝灭法、紫外分光光度有更高的灵敏度以及方法重现性好等优点。