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截短侧耳素产生菌的发酵培养基筛选和产物研究

黄宇琪  
【摘要】: 截短侧耳素是由Pleurotus mutilus和Pleurotus passeckerianus合成的一类广谱的二萜烯类抗生素。据文献报道,Clitoilus passeckerianus也能产生截短侧耳素。它通过作用于细菌核糖体50S亚基,抑止蛋白质合成,导致菌体死亡,主要用于治疗革兰氏阳性菌、支原体以及螺旋体引起的感染。 截短侧耳素由Kavanagh等在1951年首次分离并进行初步鉴定。1976年,F.Knauseder等对截短侧耳素产生菌Clitopilus passeckerianus的发酵条件、截短侧耳素的化学结构和生物合成途径进行了初步研究。此后二十年间,大量研究主要集中在其衍生物的结构与活性上,以得到高活低毒的药物。目前已有衍生物——兽用抗生素Tiamulin和Valnemulin上市,而人用抗生素Retapamulin已于2007年获FDA新药批准。由于作为半合成前体的截短侧耳素显示出大量的市场需求,高产量高纯度的截短侧耳素的获得具有实用的经济价值。 本文对实验室保存的一株真菌IMB P4-04进行形态学和分子鉴定,并测定其发酵产物的抑菌范围。通过高效液相色谱和质谱对发酵产物进行鉴定。对IMB P4-04的发酵培养基进行筛选,寻找适合产物产生的培养基组分,并对发酵产物的纯化条件进行了初步探索。 形态学观察IMB P4-04菌丝纤细且有隔。通过培养,观察不到子实体的形成。利用真菌基因组的ITS保守序列进行菌种鉴定。PCR扩增序列经测序后在NCBI中进行比对,用Vector NTI suite9.0和Clustal X绘制进化树分析,结果显示该菌与担子菌纲斜盖菇属Clitopilus prunulus的亲缘关系最近。抑菌试验显示IMB P4-04的发酵产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耻垢分支杆菌以及藤黄微球菌都具有抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的抑菌活性最高。 碳、氮源单因子试验表明IMB P4-04发酵最佳的碳、氮源分别是果糖和黄豆饼粉。考虑到果糖成本相对较高,因此选择产量第二的葡萄糖。葡萄糖、黄豆饼粉的最佳浓度分别为6%和2%。低浓度的FeSO_4对产物起促进作用,高浓度下促进作用反而减小,FeSO_4的最佳浓度为0.04%。筛选出的培养基成分为:葡萄糖6%,黄豆饼粉2%,FeSO_4 0.04%,MgSO_4 0.04%,豆油0.4%,CaCO_3 0.1%。在此条件下的发酵产物比基本培养基提高了34.6%。 用不同极性的有机溶剂萃取产物,比较回收率和纯度。乙酸乙酯的提取纯度和产物回收率均最高,其提取纯度和回收率分别能够达到77.6%和87.8%。此外,经过对萃取的pH值和萃取剂体积的摸索,发现中性条件下纯化效果比较好。萃取体积影响比较明显。最后确定的萃取条件为:等体积乙酸乙酯进行萃取,pH7.0-7.5。将萃取产物溶解于甲醇溶液,进行分步结晶,得到纯度为93.1%的晶体。 高效液相色谱分忻,表明发酵产物与标准品具有几乎相同的保留时间;质谱分析,证实发酵产物与截短侧耳素标准品具有相同的谱学特征,证实发酵产物确为截短侧耳素。


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