SSR标记和SCAR标记对片形吸虫的分类鉴别研究

【摘要】： 片形吸虫是一种危害牛羊等反刍兽和人类的寄生性蠕虫,常见的有两个种:肝片吸虫(Fasciola hepatica)和大片吸虫(Fasciola gigantica)。牛、羊片形吸虫病呈全球性流行,在全球每年造成约20亿美元的经济损失。同时该病的人畜共患性也给疫区人民的身体健康带来严重危害。两种片形吸虫在形态上及其相似,但在虫体抗原性、免疫原性、对宿主的致病性、对药物的敏感性等方面均存在差异,所以正确鉴别片形吸虫的种类,不仅是研究片形吸虫的基础及前提,且也对防治片形吸虫病具有重要意义。长期以来,片形吸虫的分类鉴定主要依据成虫的形态、生活史、流行病学等特征来进行,这在分类学的发展上曾经起了重要的作用。但由于片形吸虫种内个体差异较大,同一虫种又因宿主种类、宿主反应的不同而异,导致虫体的形态不规则。鉴于传统分类方法的局限性,研究人员不得不另辟途径。随着细胞学、分子生物学的发展,学者们开始从细胞、分子水平探讨片形吸虫的遗传变异及分类,其中分子遗传学分类方法是近年来的研究热点。虽然研究者建立了多种分类方法,但得到的结果却存在一定差异,所以人们不得不转向其它的分类方法。SSR标记和SCAR标记是近年来发展起来的新型分子标记。SSR由于种类多、分布广泛、高度多态性、杂合性高、重组率低、按孟德尔共显性方式遗传等优点,非常适用于寄生虫虫种的鉴别和分类学的研究。SCAR标记是一种十分稳定的分子标记,方便、快捷、可靠,可以快速检测大量个体,结果稳定性好,重现性高,这两种标记为片形吸虫的分类提供了思路。 本课题从重庆、四川、广西采集不同宿主片形吸虫成虫样本,并用SSR标记和SCAR标记对其进行研究。一、用SSR标记进行研究:提取片形吸虫DNA,利用网上搜寻的SSR引物对其进行扩增,PAGE电泳,根据电泳结果进行片形吸虫的遗传多样性分析和聚类分析;二、用SCAR标记进行研究:提取片形吸虫DNA,利用6种ISSR引物对其进行扩增,从中寻找片形吸虫的特异片断,并回收克隆测序,根据测序结果重新设计SCAR引物进行转化,使其能有效区分不同种的片形吸虫。获得的主要结果如下: 1.网站http://bioinformaties.pbebase.latrobe.edu.au cgi-bin/ssr提供各种物种的EST-SSR序列及其引物,从中搜索片形吸虫的SSR序列,得到4条,由于数量太少,所以我们同时搜索了近源种日本血吸虫和曼氏血吸虫SSR序列,分别得到了6183条和8133条序列。通过设定筛选条件,共筛选了17对SSR引物,其中片形吸虫SSR引物4对,日本血吸虫SSR引物6对,曼氏血吸虫SSR引物7对。用这17对SSR引物对8个来自重庆、四川和广西的不同宿主的片形吸虫样本进行扩增,PAGE电泳,结果显示有13对SSR引物能够进行有效扩增。13对SSR引物总共检测到了79个等位基因,每对SSR引物能检测到4-10个,平均为6.2个,反映了片形吸虫的遗传多态性较高。 2.根据SSR条带,构建0,1矩阵,并用NTSYS-pc软件计算8个片形吸虫样本之间的遗传相似系数。结果表明,片形吸虫种间差异为0.425—0.5,肝片吸虫种内差异为0.2—0.4,两株大片吸虫种内差异为0.3625,说明片形吸虫种间差异大于种内差异,种内变异也比较明显。 3.根据相似系数用NTSYS-pc软件对本研究的8个片形吸虫样本进行聚类,8个样本被聚为两类,第一类为大片吸虫,包括广西水牛源样本和重庆水牛源暂定种样本,第二类为肝片吸虫,包括重庆奶牛源、黄牛源、水牛源和黄羊源样本以及四川牦牛源样本。第二类又可以分为两个亚类,第一亚类为四川牦牛源样本,第二亚类包括除重庆水牛源暂定种样本外其他采自重庆不同宿主的片形吸虫样本。初步说明SSR标记不仅能够区分大片吸虫和肝片吸虫,还能够区分出片形吸虫的不同地理株。 4.用6种ISSR引物对来源重庆、四川以及广西的片形吸虫进行PCR扩增,结果发现引物(GACA)_4和引物(AG)_8能够扩增出特异片断,其中引物(GACA)_4能在肝片吸虫中扩增出两条900bp左右的特异片断,命名为ISSRF.h1和ISSRF.h2,能在大片吸虫中扩增出一条约900bp的特异片断,命名为ISSRF.g;引物(AG)_8能够在肝片吸虫中扩增出一条300-400bp的特异片断,命名为ISSRF.h3。将这些片断回收克隆测序,序列结果显示,ISSRF.h1片断长919bp,ISSRF.h2片断长806bp,ISSRF.h3片断长364bp,ISSRF.g片断长845bp。 5.根据测序结果,在片断两端包括ISSR引物再延伸4-7bp设计了4对SCAR引物,其中3对肝片吸虫SCAR引物,命名为SCARF.h1、SCARF.h2、SCARF.h3,1对大片吸虫SCAR引物,命名为SCARF.g。以所采集的样本进行验证实验,结果表明,3对肝片吸虫SCAR引物均能在肝片吸虫中产生一条特异条带,在大片吸虫中均没有扩增;1对大片吸虫SCAR引物能在大片吸虫中产生一条特异条带,在肝片吸虫无扩增。表明4个SCAR标记均转化成功,它们能有效区分不同种的片形吸虫。 6.从重庆地区的水牛体内采集到一株片形吸虫,它具有不典型形态,体长＞3cm,长宽比＞3,肩不明显,后端钝圆,睾丸占体长的2╱3,难以判定其种别,怀疑为“中间型”。经SSR标记和SCAR标记鉴定,我们认为这是一株形态不典型的大片吸虫。